DNA甲基化与关键转录因子对鸡NLRC5转录调控的初步研究

发布时间：2020-10-23 13:16

　　 2010年首次在小鼠上发现新型NOD样受体NLRC5基因,NLRC5是NLR家族最大的成员,大量研究表明NLRC5在固有免疫和获得性免疫中有重要的作用,但其自身的调控机制尚不明了,因此为了探究NLRC5基因启动子自身调控原理,本研究首先检测了鸡NLRC5基因在鸡不同组织中的表达特异性,利用软件预测NLRC5启动子区的CpG岛,并通过亚硫酸氢盐修饰后BSP检测DF1和HD11细胞中NLRC5启动子区的甲基化状态,利用甲基化转移酶抑制剂5-aza-cd处理细胞,比较甲基化程度与基因表达的关系,并最终通过启动子竞争结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法来验证甲基化影响基因表达的转录因子。克隆了NLRC 起始密码子前2265 bp的启动子区,构建启动子区系列缺失载体,转染DF1细胞,根据双荧光素酶实验确定不同缺失片段活性高低从而确定关键调控区域,预测分析关键调控区域内可能存在的反式作用元件,利用启动子竞争结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法来验证顺式元件及对NLRC5启动子活性的影响。最后通过LPS和IFN-y处理HD11细胞,RT-qPCR以及ELISA确定NF-κB激活条件,并验证鸡NLRC5基因启动子区NF-κB顺式作用元件,结果表明:1.RT-qPCR检测到NLRC5在鸡脾脏、肝脏等免疫相关组织的表达量显著高于心脏、肌肉等组织,并且检测NLRC5基因在鸡巨噬细胞系HD11中的表达量显著高于鸡成纤维细胞系DF-1。2.为探讨NLRC5启动子区的甲基化对转录水平的影响进行了一系列实验,其中MethPrimer 预测发现 2 个 CpG 岛:-4060 到-3428,共 663 bp 和-3344 到-3027,共 318 bp;BSP实验结果表明DF1处于高甲基化状态,而HD11甲基化水平较低,利用不同浓度甲基化转移酶抑制剂5-aza-cd处理两种细胞,CCK-8检测细胞存活率,定量检测相关基因的表达,发现40μmol/L终浓度5-aza-cd处理条件下,细胞DF-1存活率相比对照组差异极显著(P0.01),并对处理细胞进行甲基化检测发现具体甲基化降低位点。并最终构建该区域缺失载体转染双荧光素酶实验、启动子结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法确定甲基化通过E2F转录因子影响NLRC5基因的转录调控。3.为寻找NLRC5启动子-2265到-1区域的潜在调控元件,利用JASPAR软件分析发现NLRC5启动子-2265到-1间可能存在的转录因子结合位点,构建缺失载体进行双荧光素酶实验确定三个活性较高的区域,启动子竞争结合转录因子实验发现在-459区域存在STAT1转录因子,针对该核心区域的顺式元件STAT1的点突变和凝胶迁移实验进一步确认了该区域内存在STAT1顺式元件,其在NLRC5基因启动子活性调控过程中能够发挥重要作用。4.为寻找NLRC5启动子区的NF-κB转录因子结合位点。利用过表达结合缺失载体确定NF-κB可能结合区域,利用脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)刺激鸡巨噬细胞HD11,发现10ng/mlLPS刺激8小时和1ng/mlLPS+10ng/mlIFN-γ刺激12小时能有效激活细胞中的NF-κB,最终EMSA验证-2423和-2342存在两个NF-κB反式作用元件。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S831
【部分图文】：

图１－２?ＮＬＲ家族分子结构模式图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＮＬＲ?ｆａｍｉｌｙ??

荧光定量结果显示，鸡＃Ｚｉ？Ｃ５基因在不同组织中的转录和分布明显不同，各个组织之??间表达差异极显著（ＰＣＯ．Ｏｌ），在脾脏表达远远高于其他组织（Ｐ＜０．０１），其次在肝脏??和胸腺中表达也较高（尸＜０．０１?），而在胸腿肌以及肺脏（ＰＣ０．０１）中转录量较低（图２－２），??表明其在免疫相关组织中表达量较多，而在肌肉等组织中几乎不表达。而ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ结果??（图２－３），发现其蛋白水平表达趋势和定量结果一致。??

?＜〇?＜＜＞?＼??Ｔｉｓｓｕｅ??图２－２鸡ｊＶｉｉ？Ｃ５?ｍＲＮＡ在不同组织中的相对表达量??Ｆｉｇｕｒｅ２－２?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＴＶＩｉＪＣＪ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ??注：１－１１：分别为睾丸（卵巢）、脾脏、肾脏、法氏囊、肠、肺脏、胸腺、肝脏、心脏＇胸肌，腿??肌。不同字母表示差异极显著（Ｐ＜０．０１）。??１－１１?：Ｔｅｓｔｉ，ｓｐｌｅｅｎ？ｋｉｄｎｅｙ，ｆａｂｒｉｃｉｕｓ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．ｌｕｎｇ，ｔｈｙｍｕｓ，ｌｉｖｅｒ，ｈｅａｒｔ．ｐｅｃｔｏｒａｌｅｓ，ｃｒｕｒｅｕｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｌｅｔｔｅｒｓ??ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｔｈａｔ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ?ｉｓ?ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ?（Ｐ＜０．０１）??肺肝脾肌肉胸腺肾肠??ＮＬＲＣ５?＊??ＧＡＰＤＨ?轉麵翻麵麵睡麵麵??图２－３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂ?ｌｏｔ检测鸡规仉巧蛋白在不同组织中的表达量??Ｆｉｇｕｒｅ２－３?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＮＬＲＣ５?ｐ
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 曹丽霞,马有志,杨俊英;应答非生物胁迫的植物转录因子[J];内蒙古农业科技;2005年05期

2 张维山,冷启新;转录因子假结合体的基因治疗作用[J];解剖科学进展;2003年01期

3 苏中启;分子生物学研究的新焦点：转录因子[J];世界科学;1995年08期

4 周少燕;;转录因子网络与植物对环境胁迫的响应分析[J];南方农业;2016年12期

5 李洁;植物转录因子与基因调控[J];生物学通报;2004年03期

6 吴乃虎,刁丰秋;植物转录因子与发育调控[J];科学通报;1998年20期

7 王传琦;孔稳稳;李晶;;植物转录因子最新研究方法[J];生物技术通讯;2013年01期

8 周晓斌;杨丽霞;;锌指样转录因子2与动脉粥样硬化[J];心血管病学进展;2012年02期

9 李德,何国祥;血管平滑肌细胞增殖相关转录因子的研究进展[J];中国介入心脏病学杂志;2004年03期

10 单佑安,刘小华,罗向东,杨宗城;免疫细胞化学技术在转录因子激活研究中的应用[J];第三军医大学学报;2003年04期

相关博士学位论文 前10条

1 吴波;Desulfovibrio vulgaris Hildenborough的销酸盐适应机制及抗压全局转录因子功能研究[D];华中农业大学;2016年

2 段梅;脂锚定转录因子MfNACsa响应干旱胁迫的分子机制研究[D];中国农业大学;2016年

3 赵盼盼;番茄R2R3MYB转录因子家族鉴定及SlMYB41和SlMYB64基因功能研究[D];山东农业大学;2017年

4 周泉;小鼠组织器官及NCI60癌症细胞系转录因子蛋白质组学研究[D];军事科学院;2018年

5 何莉;转录因子CTCF的功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

6 王雪根;以转录因子为靶的抗肿瘤药物DECOY寡聚核苷酸研究[D];南京工业大学;2003年

7 张洪博;ERF转录因子TSRF1的功能分析[D];中国农业大学;2005年

8 于新凤;转录因子c-Jun/AP-1对食管鳞癌分化相关基因转录调控机理研究[D];中国协和医科大学;2006年

9 周洁;水稻低磷胁迫相关转录因子OsPHR1和OsPHR2的功能研究[D];浙江大学;2007年

10 李婧;小鼠bHLH转录因子家族预测及其大脑调控网络的构建[D];上海交通大学;2007年

相关硕士学位论文 前10条

1 尹晓月;发菜MAAs的结构及其合成调控的转录因子研究[D];华中师范大学;2016年

2 刘博欣;抗逆转录因子基因的克隆、功能分析及筛选[D];西北大学;2014年

3 叶淘智;水稻OsWRKY97转录因子的克隆与分析[D];四川农业大学;2017年

4 雒晓鹏;苦荞黄酮合成相关MYB转录因子的基因克隆及其功能鉴定[D];四川农业大学;2017年

5 胡曦月;玉米转录因子ZmEREB192、ZmEREB25参与胚乳淀粉合成的研究[D];四川农业大学;2017年

6 朱鹏飞;DNA甲基化与关键转录因子对鸡NLRC5转录调控的初步研究[D];扬州大学;2018年

7 张漫;转录因子Sp1、E2F1调控AQP3表达影响细胞迁移、侵袭分子机制研究[D];大连医科大学;2018年

8 赵恒伟;调控三七皂苷生物合成转录因子的克隆与功能研究[D];昆明理工大学;2014年

9 王晓荣;丹参bHLH类转录因子的基因克隆及功能初步研究[D];上海师范大学;2015年

10 黄强;丹参两个ERF类转录因子的克隆与功能分析[D];上海师范大学;2015年

本文编号：2853091