猪WFIKKN2基因启动子区甲基化及mRNA表达水平研究

发布时间：2020-10-23 15:29

　　 随着社会发展,人们对高品质猪肉的需求日益增加。外来品种猪生长速度快,肉的口感却不佳,而我国地方品种猪肉质优良,但生长速度慢、瘦肉率低。杂交育种可快速提高猪肉品质,而研究与骨骼肌生长发育相关的分子机制可加快杂交育种进程,充分发挥杂种优势。研究表明,有诸多基因可影响骨骼肌生长发育,其中WFIKKN2蛋白通过结合肌肉生长抑制素调控骨骼肌生长发育。WFIKKN2基因又称生长分化因子相关血清蛋白1(GASP1),属于FS家族。本实验以同日龄杜洛克猪、陆川猪及正反交F1代为研究对象,检测WFIKKN2的启动子活性,比较不同猪背最长肌WFIKKN2基因表达差异,从DNA甲基化角度研究mRNA表达差异机制,并对WFIKKN2基因进行了相关生物信息学分析,构建陆川猪WFIKKN2基因的组织表达谱,研究不同组织甲基化水平,以期为今后猪育种工作提供理论依据。具体研究结果如下:1.截取发布于NCBI上猪WFIKKN2基因5'端上游1819bp调控序列作为启动子待研究区域,运用相关软件预测该区域核心启动子位置、转录因子结合位点、转录起始位点以及TATA-box等结构。实验成功克隆了杜洛克猪、陆川猪及正反交F1代的WFIKKN2基因启动子区1819bp序列。实验利用启动子双荧光素酶报告基因系统验证启动子活性,结果表明四种猪的WFIKKN2基因启动子待研究区域均具有活性,且杜洛克猪和正交杜陆猪的启动子待研究区域活性均显著低于陆川猪和反交陆杜猪(P0.05);2.利用实时定量PCR检测WFIKKN2基因在四种猪背最长肌中mRNA表达量,发现杜洛克猪与正交杜陆猪WFIKKN2基因表达量均显著低于陆川猪和反交陆杜猪(P0.05)。通过在线软件预测到WFIKKN2基因启动子区存在一个长度为526bp的CpG岛,采用重亚硫酸盐测序法检测四种猪背最长肌中的WFIKKN2基因启动子CpG岛整体甲基化水平,发现杜洛克猪与正交杜陆猪CpG岛整体甲基化率均显著高于陆川猪和反交陆杜猪(P0.05),且甲基化水平与mRNA表达量呈显著负相关。为进一步探究CpG岛甲基化水平是否影响启动子活性,本实验以杜洛克猪和陆川猪背最长肌组织DNA为模板,构建包含CpG岛的启动子缺失片段荧光素酶报告基因载体。验证启动子缺失片段活性,发现杜洛克猪活性显著低于陆川猪(P0.05)。预测发现CpG岛序列中存在多个SP1转录因子结合位点,推测WFIKKN2基因启动子CpG岛甲基化影响SP1转录因子与启动子结合,导致启动子活性降低从而抑制mRNA表达。3.实验成功克隆陆川猪和杜洛克猪WFIKKN2基因CDS区,生物信息学分析表明陆川猪WFIKKN2基因CDS区长度为1743bp,编码580个氨基酸;陆川猪核苷酸序列与杜洛克猪相比共有15处碱基不同,其中7处为错义突变;WFIKKN2基因在不同哺乳动物中保守性强;WFIKKN2蛋白具有亲水性,属于分泌蛋白;氨基酸序列中存在多个潜在糖基化与磷酸化位点,这些位点可能影响WFIKKN2蛋白生物学功能。实验构建了陆川猪WFIKKN2基因组织表达谱,表明该基因在不同组织中均有表达。通过BSP法检测心脏和肾脏中WFIKKN2基因启动子CpG岛甲基化水平,发现心脏的CpG岛整体甲基化率显著小于肾脏(P0.05),而WFIKKN2基因在心脏中的表达量显著高于在肾脏中的表达量(P0.05)。故推测在不同组织中,WFIKKN2基因启动子区CpG岛甲基化也抑制mRNA表达。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S828
【部分图文】：

图１－３杜陆猪和陆杜猪??Ｆｉｇ．?１－３?Ｄｕｌｕ?ｐｉｇ?ａｎｄ?Ｌｕｄｕ?ｐｉｇ??

被农业部列入国家级遗传资源保护品种［ＩＧ，ｎ］。陆川猪繁殖性能强，初产母猪平均产仔数??达１０．１７头，经产母猪平均产仔数达１２．４２头，在育种中通常作为母本［１２］。本实验所用??陆川猪见图１－２。??杂交Ｆ１代正交杜陆猪和反交陆杜猪分别以杜洛克猪和陆川猪作父本杂交而成，全??身为黑色，研究表明杂交后代在瘦肉率、屠宰率和体型方面偏向于杜洛克猪，在肉品质??方面，低于陆川猪但优于杜洛克猪，遗传陆川猪肉品质好和繁殖力高等性状，但正反交??猪在肉质方面差异不显著［１３］。本实验所用正反交猪见图１－３，图中左侧为正交杜陆猪，??右侧为反交陆杜猪。??图１－１杜洛克猪?图１－２陆川猪??Ｆｉｇ．?１－１?Ｄｕｒｏｃ?Ｆｉｇ．?１－２?Ｌｕｃｈｕａｎ?ｐｉｇ??ＭＢ??ｆ：??图１－３杜陆猪和陆杜猪??Ｆｉｇ．?１－３?Ｄｕｌｕ?ｐｉｇ?ａｎｄ?Ｌｕｄｕ?ｐｉｇ??２??

１５７１?１６２１?０．９８?ＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＭＴＣＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴ??１６３６?１６８６?０．９５?ＧＧＡＧＣＩＣＣＣＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧ??图２－２?ＷＦＩＫＫＮ２基因核心启动子区域预测??Ｆｉｇ．?２－２?Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｃｏｒｅ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ＷＦＩＫＫＮ２?ｇｅｎｅ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??２．３．１．２?ＷＦＩＫＫＮ２基因启动子转录因子结合位点及ＴＡＴＡ－ｂｏｘ预测??利用?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｓｃａｎ、ＡｌｉＢａｂａ２．１、Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ?软件预测?ＷＦＩＫＫＮ２?基因?１８１９ｂｐ?启动子??区域存在的转录因子结合位点以及ＴＡＴＡ－ｂｏｘ，预测结果显示，该区域存在多个转录因??子结合位点，当ＴＡＴＡ－ｂｏｘ的阈值设置为０．８时，在１６１２ｂｐ位置存在一处ＴＡＴＡ－ｂｏｘ结??构
【参考文献】

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本文编号：2853209