基质蛋白氨基酸位点突变的新型重组水泡性口炎病毒构建及研究

发布时间：2020-10-24 00:28

　　 重组水泡性口炎病毒(recombinant vesicular stomatitis virus,rVSV)因其可以高效的表达外源蛋白、在病毒感染时为宿主提供有效的保护以及可以诱发机体产生强的细胞免疫和体液免疫应答等优点而被广泛用于疫苗和肿瘤治疗研究。但是VSV在小鼠中具有神经毒性,且当VSV直接注射到牛和马的脑中时,会引起一些神经系统疾病。因此,野生型的VSV在使用上存在一定的生物安全风险。因此,我们急需对VSV载体疫苗进行改造,以期得到对宿主无致病性或致病性较低的rVSV。VSV的基质蛋白M是一种多功能蛋白,在病毒感染过程中参与宿主转录、核质转运和翻译。野生型VSV的M蛋白可以通过抑制宿主I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达而抑制宿主的先天性免疫应答,因此,M蛋白与VSV的致病性密切相关。研究表明,M蛋白的第51位甲硫氨酸突变为精氨酸(VSV_(M51R))或发生缺失(VSV_(?M51))的重组VSV,抑制宿主基因表达的能力降低且致病性减弱。此外,Hoffmann等研究也表明,M蛋白的第221、226位氨基酸位点是两个有潜在致弱功能的氨基酸位点,然而这两个位点在VSV致病性形成上的确切意义,尤其在动物体内还未有详细的探讨和研究。为此,本文针对该病毒基质蛋白M的第221、226位氨基酸进行了定点突变,制备了新型重组VSV。突变位点是第221位缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F),第226位丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)。利用体外试验和体内试验对新型重组病毒的致病性进行了研究。其中体外实验有:(1)在PC3和PEF细胞中进行的多步生长曲线测定;(2)不同病毒诱导细胞I型干扰素表达;(3)不同M蛋白突变株感染对宿主细胞基因表达抑制效率研究。体内试验中,我们选用BABL/c小鼠来评估不同重组VSV的致病性,主要衡量指标包括接种病毒后,小鼠体重变化、致死率以及小鼠肺和脑组织中病毒载量的测定。体外试验结果表明,相比野生型VSV以及221、226单位点突变VSV,221、226双位点突变重组VSV病毒(VSV_(M221,226))的增殖能力显著降低,其致弱效应可能是由于病毒感染有效激活宿主细胞产生I型干扰素所致。在小鼠体内试验中,VSV_(M221,226)较野生型VSV以及221、226单位点突变VSV致病力明显下降。VSV_(M221,226)有希望成为一个安全、有效的疫苗载体。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65;Q78
【部分图文】：

上海交通大学硕士学位论文VM221、VSVM226、VSVM221,226质粒的构建利用基因克隆的方法构建了基质蛋白氨基酸位点突变的 pVSV（21、pVSVM226和 pVSVM221,226），接着通过反向遗传技术获得对应的SVM221、VSVM226和 VSVM221,226）。其中，M221 是指基质蛋白第 221）突变为苯丙氨酸（F），M226 是指基质蛋白第 226 位丝氨酸（S）（R），而 M221,226 是指这两个位点同时发生突变。如图 2-1 所示

(b)图 2-2 重叠 PCR 的结果Fig.2-2 The results of overlapping PCR第一轮 PCR M. DNA Marker；1.引物 P1 和 P2 的 PCR 产物P3 和 P8 的 PCR 产物（F2）第二轮 PCR M. DNA Marker；1. 引物 P1 和 P8 的 PCR 产物因片段）；f overlapping PCR. M. DNA Marker； 1. PCR products of p(F1)；2. PCR products of primers P3 and P8 (F2)；d of overlapping PCR. M. DNA Marker； 1. PCR products oP8 (Mutated M gene fragments)；鉴定特征谱带显现为四条不同大小的蛋白条带，分别为一个糖基化蛋白，其目的条带约为 60 kDa，N 与 P为一条条带，其蛋白的分子量大小约 47 kDa，M 蛋染 VSVXN2、VSVM221、VSVM226及 VSVM221,226的 IB后制备的样品进行 Western blot 鉴定，其中一抗为

图 3-1 PC3 细胞中多步生长曲线Fig.3-1 Multi-step growth curve of recombinant VSVs in PC3 cellsVSVXN2、VSVM221、VSVM226及 VSVM221,226在 PEF 中的多不生长曲线如图，野生型 VSV 可以在 PEF 细胞中有效的复制。在感染的 12~24h 内，VSV的细胞上清的滴度从 1.6±0.3×103pfu/mL 上升至 3.6±0.5×105pfu/mL，VSVM现较为一致的上升趋势，从 1.6±0.3×103pfu/mL 上升至 2.3±0.1×105pfu/mVM221从 8.9±0.2×102pfu/mL 上升至 3.6±0.4×104pfu/mL，然而，VSVM221,226胞后，细胞上清中病毒滴度一直保持平稳，即 VSVM221,226在 PEF 细胞中不
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本文编号：2853754