蒙古马源纤维素分解菌的筛选鉴定及纤维素酶基因的克隆与表达

发布时间：2020-10-24 01:36

　　 马属于单胃动物,后肠系统较为发达,是食物消化吸收的主要场所。肠道微生物对马消化纤维素起到重要作用。蒙古马以放牧为主,长期生活在草原上,形成了较强的适应性、耐粗饲等优良特性,为了提高蒙古马对于饲草料的利用率,本研究以蒙古马盲肠内容物为实验材料,旨在筛选出降解能力较强的纤维素分解菌株,对其进行鉴定,克隆并表达出具有纤维素酶活性的外源性蛋白,为马源纤维分解菌和纤维素酶的工业生产和利用奠定理论基础。研究结果如下:(1)本研究采用羧甲基纤维素钠平板法(CMC-Na)和摇瓶发酵法进行培养和分离,筛选出一株具有较高纤维素分解能力的菌株,经革兰氏染色、生理生化特性鉴定和16S rDNA分子学方法鉴定为Bacillus amyloliquefaciens H3(解淀粉芽孢杆菌H3)。(2)研究发现Bacillus amyloliquefaciens H3生长速度快,在接种后8-32h进入对数期,32-52h为稳定期,52h后繁殖速度逐渐进入衰退期。该菌株所产生的纤维素酶最适的反应条件为pH4.8、65℃、反应5min,且具有较强的酸碱性。此外,Bacillus amyloliquefaciens H3发酵所需的最佳碳源为1%玉米粉,最佳氮源为2%的蛋白胨+酵母粉复合物(1:1),pH4.8的培养基,接种量4%,发酵至18-42h产酶量最高且保持一定程度的稳定性。(3)从蒙古马源Bacillus amyloliquefaciens H3中克隆到了纤维素酶基因(endo-beta-1,4-glucanase(egl),GenBank:KT800419.1),该基因长度为1500bp,编码499个氨基酸,属于纤维素酶中的BglC家族,其组成包括糖苷水解酶家族5(Glycoside hydrolases family 5)中的一个纤维素酶和CBM-3区域。(4)本研究成功构建出具有降解纤维素能力的乳酸工程菌,其酶活力为0.91U/mL,高于原先菌株(0.60U/mL)。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S821;Q93
【文章目录】：
摘要
abstract
1 前言
    1.1 马匹胃肠道结构及消化特点
        1.1.1 马匹胃肠道结构
        1.1.2 马匹消化吸收特点
    1.2 马匹胃肠道微生物的研究进展
    1.3 纤维素分解菌及纤维素酶的研究进展
        1.3.1 纤维素分解菌的纯培养筛选
        1.3.2 纤维素的结构和作用原理
        1.3.3 纤维素酶在饲料原料中的应用
        1.3.4 纤维素酶基因工程菌的构建
2 本研究的目的与意义
3 本研究的技术路线
4 实验一纤维素分解菌的分离鉴定及特性研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验方法
        4.1.3 纤维素分解菌的分离、筛选
        4.1.4 纤维素酶活力测定
        4.1.5 菌株的种属鉴定
        4.1.6 生长特性的研究
        4.1.7 酶学特性的研究
        4.1.8 纤维素分解菌在不同发酵条件下的产酶特性
        4.1.9 数据分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
        4.2.2 纤维素分解菌的分离和筛选
        4.2.3 纤维素分解菌的鉴定
        4.2.4 Bacillus amyloliquefaciens H3生长特性
        4.2.5 Bacillus amyloliquefaciens H3分泌纤维素酶的酶学特性
        4.2.6 发酵条件对Bacillus amyloliquefaciens H3产生纤维素酶的影响
    4.3 讨论
        4.3.1 纤维素分解菌的分离和鉴定
        4.3.2 Bacillus amyloliquefaciens H3的生长趋势
        4.3.3 纤维素酶的酶学特点
    4.4 小结
5 实验二蒙古马源Bacillus amyloliquefaciens H3纤维素酶基因的克隆与表达
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 实验方法
        5.1.3 纤维素酶基因的克隆
        5.1.4 纤维素酶基因表达载体构建
        5.1.5 纤维素酶基因乳酸工程菌的构建
    5.2 结果分析
        5.2.1 纤维素酶基因的PCR扩增结果
        5.2.2 重组质粒pMD19-BP的PCR鉴定
        5.2.3 纤维素酶蛋白结构预测
        5.2.4 纤维素酶基因表达载体构建
        5.2.5 纤维素酶基因乳酸工程菌的构建
    5.3 讨论
        5.3.1 纤维素酶基因的克隆
        5.3.2 纤维素酶基因乳酸工程菌的构建
    5.4 小结
6 结论
7 展望
致谢
参考文献
附录
作者简介

【参考文献】

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本文编号：2853833