猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立

发布时间：2020-10-24 11:51

　　 猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性传染病,引起新生仔猪神经系统紊乱及死亡,妊娠母猪死胎、流产、木乃伊胎,成年猪常为隐形感染。猪伪狂犬病毒血清型单一,疫苗免疫保护率高,目前,市场上广泛使用是基因缺失活疫苗,尤其是gE基因缺失苗,鉴于此,临床上用于区分疫苗株感染和野生毒株感染的诊断方法的建立显得尤为重要。本研究以本实验室新分离得到的PRV毒株(PRV-TX)为基础,表达并纯化gE蛋白,制备针对PRVgE蛋白的单克隆抗体,并利用单抗建立检测PRVgE抗体的竞争ELISA方法,对猪伪狂犬病的防制具有重要意义。1、猪伪狂犬病毒gE基因的原核表达根据Genbank发表的PRVgE基因序列,设计一对引物,扩增PRVgE基因的主要抗原区域,约为500bp。克隆到pET-32a表达载体上,构建原核表达重组质粒pET-32a-gE,将pET-32a-gE转化BL21感受态细胞,在16℃、220 rpm条件下,经1 mM浓度的IPTG诱导表达获得大约45 kDa大小的可溶性gE蛋白,纯化获得浓度为2.6 mg/ml的gE纯化蛋白。2、猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备将纯化后gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0进行融合,通过间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,并用有限稀释法进行三次亚克隆,最终获得了 6株能稳定分泌抗PRVgE蛋白抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2B4、3E5、4E6、5C5、5D6和5F9。间接ELISA检测6株杂交瘤细胞的腹水效价分别为1:64000、1:32000、1:64000、1:16000、1:16000和1:32000,Western blot实验结果显示,6株单克隆抗体腹水均能与PRV病毒蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)检测结果显示,2B4、5C5、5D6、5F9和4E6单克隆抗体能与PRV发生特异性反应。3、竞争ELISA方法的初步建立以PK-15细胞增殖PRV,将收获的病毒用蔗糖密度梯度超速离心法进行纯化,将纯化的病毒作为包被抗原,纯化2B4单抗腹水以辣根过氧化酶(HRP)进行标记作为检测抗体,建立针对gE抗体的竞争ELISA。对竞争ELISA的反应条件进行优化,确定抗原的最适包被浓度为0.313 mg/ml,酶标抗体的最适工作浓度为1:800,待检血清最适稀释度为1:16,血清反应的最佳时间为60 min,封闭液的最佳选择为2%BSA,显色液的最佳反应时间为10 min。并测得该检测方法的阴阳性判断标准为抑制率≧40%为阳性,反之则为阴性。运用本方法检测PCV-1、PRRSV、PPV、CSFV、PEDV和PCV-2阳性血清样品时,结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。用建立的竞争ELISA方法对IDEXX公司试剂盒检测为PRV gE阳性的90份血清,PRV gB阳性的60份血清以及PRV阴性的70份血清进行检测,结果显示,PRVgE阳性血清阳性符合率为96.67%,PRVgE阴性血清阴性符合率为93.85%。综上,建立的方法特异性良好,可用于猪群PRVgE抗体的检测,用于区分自然感染和免疫动物,为伪狂犬病的净化提供了有效方法。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

２５０ｂｐ——??Ｈ）〇ｂｐ—？?．－?＿?Ｈ??图１－２．重组质粒酶切鉴定图??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１－４：?ｐＥＡＳＹ－Ｔ３－ｇＥ?重组质粒??Ｆｊｇ．１－２．?Ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ?：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?；?１?－４?：?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｏｆ?ｐＥＡＳＹ－Ｔ３－ｇＥ??３．３?ｇＥ基因重组表达质粒的构建??将阳性测序正确的ｐＥＡＳＹ－Ｔ３－ｇＥ质粒与原核表达载体ＰＥＴ－３２ａ分别用Ｂ＿ＨＩ、Ｈ／？ｄＩＩＩ??限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用１?％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分别对目的??基因与表达载体ＤＮＡ进行胶回收，用Ｔ４连接酶对回收产物进行连接，将连接产物转化??ＢＬ２１，摇菌扩增之后提质粒，重组表达质粒经Ｂ〃ｗＨＩ、Ｈ／ｎｄＩＩＩ双酶切鉴定，电泳结果如??图１－３所示，获得５５８?ｂｐ大小的条带，与预期相符。??Ｍ?１?２?３?４??［丄ｄ?ｒ??ｔ＂?

基因与表达载体ＤＮＡ进行胶回收，用Ｔ４连接酶对回收产物进行连接，将连接产物转化??ＢＬ２１，摇菌扩增之后提质粒，重组表达质粒经Ｂ〃ｗＨＩ、Ｈ／ｎｄＩＩＩ双酶切鉴定，电泳结果如??图１－３所示，获得５５８?ｂｐ大小的条带，与预期相符。??Ｍ?１?２?３?４??［丄ｄ?ｒ??ｔ＂?，：＇ｆ?＂Ｉ—５９００ｂｐ??ｌＯＯＯｂｐ—卜Ａ．．??图１－３．重组表这质粒酶切鉴定图??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１－４：?ｐＥＴ－３２ａ－ｇＥ?重组质粒??Ｆｉｇ．?１－３．?Ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?－４：?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｏｆ?ｐＥＴ－３２ａ－ｇＥ??３．４蛋白的诱导表达??将重组菌培养至ＯＤ６００的值在０．４－０．６之间，加入终浓度为１．０?ｍｒｎｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，于??

２２０ｒｐｍ诱导表达８ｈ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示，含Ｈｉｓ标签蛋白的重组菌ｐＥＴ－３２ａ－ｇＥ??经过诱导表达后比未诱导菌多出一条约４５?ｋＤａ的蛋白条带，诱导的空载体菌比未诱导菌多??出一条约１３?ｋＤａ的蛋白条带，结果均与预期大小一致（图１－４）。??Ｍｌ?２?３?４??５５?懸＿?：：?．?，１??、”，?機－你為：、＾?爱．??４０?＇?ｉ?ｍｍ?—４５ＫＤａ??泛＂、：＇??３５?ＭＭ＇??２５??图１－４融合蛋白表达的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳??Ｍ?：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：未诱导的?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１；??２：?ＩＰＴＧ?诱导的?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１；?３：未诱导的?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１；??４：?ＩＰＴＧ?诱导的?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１；??Ｆｉｇ．?１－４?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１?ｂｅｆｏｒｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；??２：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ＢＬ２１?ａｆｔｅｒ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；?３：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１?ｂｅｆｏｒｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；??４：?Ｔｈｅ?ｐＥＴ－３２ａ／ｇＥ／ＢＬ２１?ａｆｔｅｒ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；??３．５重组蛋白的可溶性分析??经诱导条件的不断摸索，得出ＩＰＴＧ浓度为１．０＿〇１／Ｌ，温度１６°Ｃ，转速为２２０ｒｐｍ??诱导时间８?ｈ是最佳诱导条件
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本文编号：2854425