禽类多瘤病毒APV-1晚期基因agno-1a的突变体构建和表达

发布时间：2020-10-24 17:59

　　 本研究通过设计和构建基因组结构与野生型APV-1病毒相同,但在APV-1晚期基因agno-1a翻译起始ATG有突变的新型重组病毒,来研究APV-1晚期基因agno-1a对该病毒晚期多顺反子翻译起始调控的机制。首先大量提取APV-1的cDNA病毒克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶AccI(部分酶切)和EcoRI(完全酶切)对质粒pHL1003进行分步酶切,得到pHL1003载体大片段。通过PCR的方法用含起始密码ATG点突变(ACG或CTG)的设计引物扩增目的小片段并用限制性内切酶AccI和EcoRI进行双酶切,然后连入pUC19载体中,以此准确获取含ACG或CTG的目的小片段。最后,用T4连接酶将突变目的小片段与pHL1003载体大片段相连接,构建能进行真核表达的重组cDNA病毒载体。将构建的含ATG突变的cDNA病毒载体质粒转染到鸡胚成纤维细胞后,用Western blot来检测重组病毒基因的蛋白表达变化。用限制性内切酶NdeI和NarI对质粒pHL1003-GFP和pHL1003突变体分别进行双酶切,获得所需要的载体大片段和目的小片段。再将突变目的片段(ATG→CTG;ATG→ACG)与pHL1003-GFP载体片段分别相连构建含报告基因EGFP的表达载体(即用GFP基因替代VPs基因)。通过转染鹌鹑胚成纤维细胞后使用荧光显微镜观察荧光表达量。结果表明,质粒pHL1003表达了VP1/2和Agno-1a三种蛋白,VP1为最大量的蛋白;质粒pHL1003-CTG也表达了Agno-1a和VP1蛋白,但VP1的数量和比例要比Agno-1a蛋白的表达量要少很多。三种APV-1 cDNA-GFP表达质粒转染鹌鹑纤维细胞后,pHL1003-GFP转染的细胞内荧光蛋白量较多。而质粒pHL1003-GFP-CTG和pHL1003-GFP-ACG转染鹌鹑胚纤维细胞后,细胞内荧光蛋白的表达量比pHL1003-GFP转染细胞的表达荧光蛋白量要少的多。因此,在APV-1晚期基因中agno-1a ATG突变明显影响着下游基因的翻译表达。这暗示了Agno-1a蛋白作为病毒晚期多顺反子基因的前导蛋白可能对其下游基因(GFP或VPs)的翻译表达起关键的调控作用。
【学位单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

图 1.1 APV 全基因组线性图[44]Fig 1.1 avian polyomavirus genome map[44]APV-1 病毒与哺乳类动物多瘤病毒 SV40，在结构上都具备了，外显子和内含子，和含有基因序列不连续的特点。在 DNA 启动转录后，需要将内含子去除

图 1.2 在 PL1 启动下的双顺反子 a 和三顺反子 b[45]Fig 1.3Under the PL1 promoter, the a (Three CIS trans) and the b (CIS)[45]在进一步的研究中，设计关于 APV-1 病毒在感染的宿主鸡胚成纤维细胞CEF 中的动力学实验观察病毒蛋白表的达，并利用 Western Blot 的方法检测

图 1.3APV-1 病毒感染鸡胚成纤维细胞不同时间段的瞬时蛋白表达量[45]1.3 Transient APV-1 viral expression of chicken infected with virus at different time 的起始机制
【参考文献】

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本文编号：2854805