本研究利用CRISPR-Cas9系统和体细胞核移植技术制备了EDAR基因打靶绒山羊动物模型,观察到了EDAR基因打靶绒山羊头顶没有毛发、皮肤毛囊异常等特征,并且采用第二代高通量测序技术结合生物信息学的方法对EDAR基因打靶绒山羊皮肤差异表达基因进行分析。研究结果为今后进一步探究EDAR基因在绒山羊皮肤毛囊生长发育中的调控作用奠定了基础。一、阿尔巴斯绒山羊EDAR基因打靶sgRNA的制备根据绒山羊EDAR基因的特点,本研究选择在EDAR基因的第6号外显子中设计了sgRNA1和sgRNA2两个方向相反的sgRNA序列。经过检测发现,这两个sgRNA均具有对EDAR基因的敲除活性。因此本研究选择sgRNA1+sg RNA2+Cas9组合作为绒山羊EDAR基因打靶实验时所选用的sgRNA。二、EDAR基因打靶阳性细胞的筛选通过电穿孔法将打靶质粒转入绒山羊胎儿成纤维细胞中,比较了口吸管法、流式细胞仪分选法和稀释法三种单克隆细胞的筛选方法,使用这些方法时细胞克隆形成率分别是18.75%、23.61%和62.86%。在可操作性方面,由于稀释法更加简单,因此本研究中利用稀释法进行单克隆细胞的筛选。通过单克隆细胞的培养,共成功获得了89株细胞系,经过测序分析发现其中有62株细胞发生了突变,突变效率为69.66%。其中单等位基因突变率为37.1%,双等位基因突变率为32.6%。经过对各细胞系的靶位序列进行比对分析,共发现了九种突变类型。其中编号为5069的细胞系生长状态良好,鉴定为II型突变类型,因此选择其作为制备EDAR基因打靶绒山羊时的核供体细胞。三、利用体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊在制备EDAR基因打靶绒山羊克隆胚胎时,共收集了3339枚山羊卵母细胞,通过成熟培养获得了1875枚成熟的卵母细胞。在成功构建了1853枚克隆胚胎中有1557枚胚胎融合并且有1543枚胚胎被激活,最终获得了329枚2细胞胚胎、430枚4细胞胚胎和107枚8细胞胚胎。同时也发现EDAR基因打靶克隆胚胎的融合率显著高于野生型的克隆胚胎,但在其他阶段并没有观察到显著差异。本研究共完成了79例受体羊的胚胎移植手术。手术后经过探查发现有5只受体羊妊娠,妊娠率为6.3%。经过5个月的妊娠共有6只羔羊出生,均为雄性,其中2只出生时即为死胎,2只出生后分别存活20小时和24小时后死亡。另外2只生长状态良好。所有EDAR基因敲除绒山羊均未检测到EDAR蛋白的表达,且均具有头顶没有毛发、皮肤干燥的外表特征。通过对其皮肤组织切片进行分析发现:EDAR基因打靶绒山羊的头部皮肤组织中没有任何毛囊结构,在背部和体侧均发现了不同直径的毛囊散布在皮肤中,并且它的毛囊排列并不像野生型那样具有典型的三毛型毛囊结构。同时,通过测量各部位皮肤样本切片中毛囊的直径发现:野生型绒山羊皮肤样本中以直径为30μm的毛囊为主要组成部分,而EDAR基因打靶绒山羊皮肤样本中的毛囊以直径为20μm的毛囊为主要组成部分。并且直径大于50μm的毛囊在EDAR基因打靶绒山羊皮肤样本中比野生型更多。同时也检测了关于sgRNA1和sgRNA2靶位预测的43个潜在的脱靶位点,并没有发现任何的脱靶突变事件。四、EDAR基因打靶绒山羊与野生型绒山羊皮肤基因差异表达分析对野生型和EDAR基因打靶绒山羊皮肤样本进行高通量测序,共获得了285,039,622条Raw Reads。经过数据过滤,获得了277,261,506条Clean Reads。过滤后,样本总序列中,质量值大于30(错误率小于0.1%)的碱基数的比例均为90%以上。将EDAR基因打靶绒山羊与野生型绒山羊各部位皮肤样本的基因表达进行比较,获得了各组的差异表达基因。在头部皮肤EDAR01与WT01样本比较中共有4899个差异基因,其中有2441个差异基因上调表达,有2458个差异基因下调表达。在背部皮肤EDAR02与WT02样本比较中共有2151个差异基因,其中有1302个差异基因上调表达,有849个差异基因下调表达。在体侧皮肤EDAR03与WT03样本比较中共有2094个差异基因,其中有1117个差异基因上调表达,有977个差异基因下调表达。在EDAR基因打靶和野生型绒山羊各皮肤样本中共有732个差异表达基因,其中有395个差异基因上调表达,有337个差异基因下调表达。比较得到的所有表达差异基因进行GO功能分析,在生物过程这个类别中,细胞过程、单组织过程和生物调控三个模块的差异表达基因数量最多。在细胞组分这个类别中,细胞部分、细胞器和膜部分三个模块的差异表达基因数量最多。在分子功能这个类别中,结合、催化和转运三个模块的差异表达基因数量最多。对KEGG中每个信号通路应用超几何检验进行富集分析,神经活性配体-受体相互作用、视黄醇代谢和药物代谢-细胞色素P450信号通路在各组样本中均差异表达基因显著性富集。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S827
【部分图文】：
有机串联起来锌指核酸酶识别。其中，锌指核酸酶的-1、+3、+6位残基对靶序列的特异性识别至关重要。图1.1 锌指核酸酶的模式图[30]Figure 1.1 Diagram of zinc-finger nucleases目前的实验研究中，模块组装法与寡聚体库工程法是研究人员常常制备锌指核酶结构域的手段。模块组装法是将每个可以识别和结合三联碱基的锌指根据靶基因序列的特点一一串联起来，就像是把不同的模块组合在一起一样，这样的优点在于操作简便，但是由于其没有顾忌到其对上下游序列的影响，因此也具有一定的弊端，例如较大的脱靶效率和组装效率差同时也导致了较大的细胞毒性。而寡聚体库工程法则是利用锌指资源库，由于每个锌指对应的三联碱基不同，因此不同的氨基酸序列产生了多个锌指结构域，这样就把不同的锌指库连接在起来形成了不同的锌指组合，选择亲和性好的锌指组合便有助于下游基因的表达，尤其是药物筛选标记基因
部的磁场调整磁珠的位置，通过体处理自动化的处理得到目的TALEN重复序列，这样的方法效率非常高。图1.2 转录激活样效应蛋白质核酸酶的模式图[33]Figure 1.2 Diagram of transcript activator-like effector nucleases1.5 RNA 介导的 DNA 编辑（CRISPR-Cas9）CRISPR是是一小段规律成簇的间隔短回文重复序列，长约24-47bp，包括同向的重复序列和非重复间区序列。Cas是一种核酸内切酶，它与CRISPR序列相关。
利用 CRISPR-Cas9 系统与体细胞核移植技术制备 EDAR 基因打靶绒山羊的研究一段长度为20个核苷酸的单向导RNA可以与靶序列结合，这样CRISPR-一起构成了RNA引导性的核酸酶系统[34,35]。在相同物种中，CRISPR位重复序列是比较保守的，但是它的部分间区序列与噬菌体等生物的外源NA具有比较高的同源性，因此这些同源部分被称为前间区序列。
【参考文献】
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