J亚群禽白血病病毒抗体快速检测试纸条的研制

发布时间：2020-10-26 14:18

　　 J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis Virus,ALV-J)引起的肿瘤性传染性疾病。ALV-J自1988年在英国被发现并鉴定以来,迅速传播到其他国家及地区,在世界范围内广泛流行,遍布全部的养鸡国家。ALV-J既可水平传播,又可垂直传播。J亚群禽白血病主要临床表现为多种肿瘤性病变,导致鸡的体重增长缓慢、鸡群的产蛋率下降、免疫抑制等,给养鸡业带来巨大的经济损失。我国自1999年在商品代肉鸡中分离并鉴定出ALV-J以来,ALV-J在我国鸡群中普遍流行,并且扩散到中国地方品系鸡群,逐渐成为近些年危害最严重的传染病之一。建立准确、快速、灵敏的检测技术进行种群净化,是控制ALV-J的有效措施。目前,ALV病原检测普遍使用检测P27的ELISA试剂盒,然而在抗体检测方面,ALV-J抗体检测试剂盒非特异性较高,检测效果不稳定。因此有必要研制一种准确、快速、灵敏的试纸条,用来检测ALV-J抗体。1、鼠抗鸡IgG单克隆抗体的制备利用饱和硫酸铵沉淀法和葡聚糖凝胶纯化法分离鸡血清的IgG,并用SDS-PAGE电泳分析鉴定鸡IgG的纯度。将获得的鸡IgG免疫7周龄BALB/C小鼠,每次间隔15d,第三次免疫后,取小鼠脾脏,采集脾脏细胞,与处于对数生长期的SP2/0细胞进行融合。通过ELISA方法筛选和三次亚克隆得到四株能够稳定分泌抗鸡IgG抗体的杂交瘤细胞,分别命名为CIgG-1H7、CIgG-2C9、CIgG--3G、CIgG-5B3。抗体亚类鉴定结果表明CIgG-1H7、CIgG-3G3、CIgG-5B3亚型均为IgG1,CIgG-2C9为IgG2a,四株单克隆抗体轻链亚类均为κ型。用间接ELISA方法测定小鼠腹水效价,结果为1:80000～1:320000。Western blot分析显示四株单克隆抗体均与鸡IgG重链反应。经过ELISA实验分析CIgG-1H7、CIgG-2C9与其他动物IgG无交叉反应。间接免疫荧光试验结果显示CIgG-3G3和CIgG-5B3两株单抗具有较好的荧光反应性。本研究中所制备的单克隆抗体为鸡病诊断试剂的研发提供了可靠的材料。2、ALV-J抗体快速检测试纸条的研制本研究在鉴定并明确ALV-J囊膜蛋白gp85特异性抗原表位的基础上,利用合成肽作为抗原建立检测血清中ALV-J特异性抗体。研究结果发现,选择多肽ALV-J-P2作为抗原,喷绘于NC膜上作为试纸条的检测线;选择研究内容一中制备的CIgG-5B3单抗作为金标抗体,制备了胶体金-抗体偶联复合物,喷涂于试纸条的金标垫上;使用商品化羊抗鼠IgG作为质控线的抗体。最终通过喷绘、组装、切条等步骤,制备了一批能够快速、灵敏、简单地检测出血清中ALV-J特异性抗体的试纸条。该试纸条可以检测出人工感染ALV-J JS09GY07病毒株鸡血清中的抗体。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

也逐步被挖掘出来［４４】。??２．１免疫胶体金技术的基本原理??氯金酸（ＨＡｕＣＵ）在还原剂的作用下，产生一定大小的金颗粒。如图１，胶体金颗粒??的结构包括位于中心的金核和双离子层，金颗粒表面包围着阴性电离子层（Ｚｅｔａ电位），金??颗粒表面的八１１（：１２＿离子层与Ｈ＋离子层分散均匀。由于静电作用使得胶体金颗粒之间有相??互排斥作用，所以能够维持胶体状态。胶体金颗粒并不是完美的圆球体，直径小于３０?ｒｎｎ??的胶体金颗粒多为是圆球体的，而较大的胶体金颗粒的形状大多为椭球体，可以通过电子??显微镜观察胶体金颗粒的大小和形态［４５］。??

图１．１?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析鸡ＩｇＧ纯化的效果??Ｍ：普通蛋白ｍａｋｅｒ?１：纯化的鸡ＩｇＧ??Ｆｉｇ．?１．１?Ｔｈｅ?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＩｇＭ：普通蛋白?ｍａｋｅｒ?１?：?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｃｈｉｃｋｅｎ?ＩｇＧ??抗体杂交株细胞的建立??测融合后的细胞上清，选取〇Ｄ值判定为阳冻存及亚克隆。三次亚克隆之后得到４株稳分别命名为ＣＩｇＧ－ｌＨ７、ＣＩｇＧ－２Ｃ９、ＣＩｇＧ－３Ｇ３定??对上述单克隆抗体亚类进行了鉴定，结果为Ｃ

我鸟?ＩｇＧ?０．０５９?０．０６５?０．０６３?０．２６８?０．２７５??兔?ＩｇＧ?０．０７４?０．０８４?０．０８２?０．０８２?０．０７８??对制备的四株单克隆抗体的反应性进行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ验证，如图１．２，?１．３，?１．４，１．５，??１．６，四株单克隆抗体与鸡ＩｇＧ的反应性较好，结合鸡ＩｇＧ的重链。??ｋＤ?Ｍ?１?２?３?４??ｉ?ｐｎ??５０?％■?．?．?Ｐ，??３５??２５??２０?？，场??图１．２血清ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图??Ｆｉｇ?１．２?Ｔｈｅ?ＳＤＳ?ｐａｇｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｓｅｒｕｍ??Ｍ：?Ｍａｋｅｒ，Ｎ４：鸡、鸭、鹅、兔血清??Ｍ：?Ｍａｋｅｒ?１－４：?ｃｈｉｃｋｅｎ、ｄｕｃｋ、ｇｅｅｓｅ、ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ??
【参考文献】

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本文编号：2857107