IL-1β对奶牛乳腺上皮细胞紧密连接的影响及作用机制

发布时间：2020-10-27 22:10

　　 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最为常见的两种细菌,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和磷脂壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)分别是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的主要毒力成分,均能引起奶牛乳腺内的炎症反应。在健康奶牛的乳腺结构中,腺泡上皮细胞之间的紧密连接参与构成血乳屏障,防止牛奶成分通过乳腺腺泡与血清相互渗透。细菌引起的乳腺炎诱发血乳屏障发生损伤时,常伴随着奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epitheiali cells,BMECs)紧密连接的变化。本研究旨在通过RNA-seq分析分别用LPS和LTA侵染奶牛BMECs引起的转录组表达变化,并探究在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎血乳屏障损伤中差异表达的促炎性因子发挥的作用。实验首先用LPS或LTA侵染奶牛乳腺上皮细胞建立体外的乳腺炎细胞模型,通过高通量测序RNA-Seq分析,筛选奶牛BMECs对这两种不同的毒力因子的差异表达mRNA。通过对差异表达基因进行分析确定在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎期间能够引起乳腺炎血乳屏障损伤的促炎因子。在这些差异表达基因中,LPS处理组中白介素1β(IL-1β)表达显著增高并且多个炎症相关的信号通路均富集了IL-1β,随后实验深入研究IL-1β在乳腺炎血乳屏障损伤过程中发挥的作用。实验进一步用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)验证IL-1β等促炎性因子的mRNA表达水平是否与测序结果相一致,并分别在患有乳腺炎和正常的乳腺组织中用qRT-PCR及酶联免疫吸附实验检测IL-1β在mRNA和蛋白水平上的表达和分泌水平,验证了IL-1β确实参与乳腺的炎症反应过程。随后,实验用外源性IL-1β处理BMECs来模拟炎症状态下增高的IL-1β对乳腺上皮细胞细胞紧密连接通透性的影响及作用机制。实验在细胞水平上用蛋白印迹(Western Blotting)和免疫荧光检测三种紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的表达,发现在IL-1β处理组的表达明显降低。通过跨上皮细胞电阻检测、中性粒细胞迁移实验和异硫氰酸荧光素FITC葡聚糖透过性实验检测等发现IL-1β处理可明显增强BMECs紧密连接通透性。在组织水平上,HE染色、免疫荧光和电镜观察上皮细胞超微结构等发现IL-1β处理过的小鼠乳腺组织血乳屏障破坏,为探究该过程是否被肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)调节,用MLCK抑制剂ML-7预处理BMECs依次进行上述实验,发现ML-7预处理过的BMECs紧密连接恢复正常。实验进一步通过ERK1/2抑制剂处理上皮细胞,通过Western Blotting和qRT-PCR检测MLCK在蛋白和mRNA水平上的表达,发现IL-1β引起BMECs紧密连接的变化是通过IL-1β-ERK1/2-MLCK信号通路引起的。上述结果表明LPS和LTA能够引起BMECs发生全基因组表达变化,IL-1β能够通过IL-1β-ERK1/2-MLCK信号通路对BMECs紧密连接及血乳屏障产生影响,这一结果为奶牛乳腺炎血乳屏障损伤的发生和奶牛乳腺炎的防治提供新的思路。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.23
【部分图文】：

LTA1、 2、3 和 LPS1、 2、3 分别代表正常对照组、LTA 处理组和 LPS 处理组的三个生物学重复。Fig 2-1. Clustering analysis of DEGs（A）LPS vs Control（.B）LTAvs Control（.C）LPS vs LTA. The red color represents the up-regulatedexpression of genes, while the green color represents down-regulated expression of genes. Gradient colorbarcode at the right top indicates log2(FPKM) value. Each row represents a gene and each columnrepresents a sample. Genes with similar expression value are clustered both at row and column level.Control 1, 2 and 3, LPS1, 2, and 3, LTA1, 2, and 3 mean three different biological repeats for each group.在热图中，LPS 处理组和 LTA 处理组和对照组相比有 10 个基因发生差异表达。其中两个差异表达基因LOC100297121 和LOC788523在LPS和LTA处理组均上调表达，没有共同下调表达的基因。另外，与对照组相比，其中有 8 个基因 CCL2, CCL20, CXCL2,CXCL3, CXCL5, CXCL6, IL-1β, 和 IFIT2 在 LPS 处理组中上调表达而在 LTA 处理组下调表达（图 2-2），这 8 个基因均为趋化因子或细胞因子。

图 2-3 KEGG 富集分析散点图ich factor 是在这一途径项中标注的不同表达的基因数与在此路径中标注的所有基因数的比意味着更强的强度。Q-value 代表优化的 p 值，越小代表越集中富集。 符号代表在三个处组中均有富集。Fig 2-3 Scatter plots for KEGG enrichment results.he Rich factor is the ratio of differentially expressed gene numbers annotated in this pathway terme number annotated in this pathway term. Greater rich factor means greater intensiveness. Q-valucted p value ranging from 0 to 1, and less Q-value means greater intensiveness. The symbol of indicates the enriched pathways shared with three pairs.18

（3）用荧光酶标仪分别在 493nm 激发光和 518nm 发射光下测定 FITC-葡聚糖不同梯度浓度的荧光强度，每个浓度测定 3 次，取 3 次测量的平均值，绘制 FITC-葡聚糖浓度与荧光强度标准曲线。（4）根据标准曲线计算不同透过时间下荧光强度，将 30min 下的未处理组设定为对照组，结果以各组与对照组的倍数显示。3.3.13 数据分析本章所涉及实验均重复 3 次，按照统计分析软件 SPSS 13.0 的单因素 ANOVA 和LSD 检验进行，结果以平均值±标准差（mean±SD）的格式呈现。并利用双尾 T 检验检测各组之间差异的显著性，*P<0.05 表示差异显著；**P<0.01 表示差异极显著。3.4 结果3.4.1.LPS 处理 BMECs 差异表达基因的验证为了验证测序结果，我们随机挑选了 20 个差异表达基因并用定量实时 PCR 验证它们的 mRNA 表达水平并与测序结果一致。（图 3-1）
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本文编号：2859130