外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成的影响及其作用机理

发布时间：2020-10-28 04:09

　　 胎盘血管的密度和大小决定着胎盘功能,对影响母猪的生产性能具有重大意义,研究胎盘血管的形成对改善母猪生产性能和胚胎健康生长具有重要价值。精胺是由细胞合成的,广泛存在于哺乳动物体内脂肪族胺类,对细胞的增殖分化具有重要作用。本项目旨在应用细胞生物学相关技术手段,从分子和细胞水平研究外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成相关基因和蛋白表达的影响,以及血管形成相关信号通路位点的基因表达。为寻找防止母猪胎盘功能不全带来的仔猪宫内发育迟缓的方法提供理论支持。为此,本项目展开如下试验:1.以正常分娩的猪脐带为材料,通过采用I型胶原酶灌注脐静脉,37℃消化15min,具有较好的内皮细胞分离效果。采用高浓度血清,促进原代细胞的生长。分离纯化后的内皮细胞通过形态学和抗CD31,抗vWF蛋白染色鉴定其为内皮细胞。2.不同浓度(0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM)的精胺不同程度的影响猪脐静脉内皮细胞的增殖,7.5μM精胺添加量对内皮细胞的增殖促进作用最大(P0.05)。以7.5μM精胺添加量为试验组进行细胞迁移和管腔形成试验。7.5μM精胺处理组中细胞迁移数量与管腔形成数量显著高于(P0.05)对照组。添加7.5μM精胺能够促进脐静脉内皮细胞体外血管形成。3.通过荧光定量PCR技术检测对照组和7.5μM精胺处理组中FGF-2、PLGF、ANG-1、VEGF-A、PI3K、AKT1、m-TOR、S6K1、MEK基因表达量。荧光定量结果表明7.5μM精胺处理组FGF-2、PLGF、m-TOR、MEK的基因表达量显著高于对照组(P0.05)。
【学位单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S828.5
【部分图文】：

试验一 猪脐静脉内皮细胞分离培养2 结果与分析2.1 脐静脉内皮细胞原代培养脐静脉血管内皮细胞培养结果如图。用I型胶原酶消化15min，可以获得数量较多的团块状细胞，团块细胞易贴壁，细胞向四周展开，细胞成活率高，活力强，4天左右铺层，适合用于后期的实验。细胞接种6小时后，部分细胞开始贴壁展开生长，细胞呈现短梭型，围绕着团块细胞为中心向周围四散铺开，培养基略微混杂，培养基中有大量死细胞，未贴壁的细胞团块。培养1天后首次换液，显微镜下观察细胞呈现不同大小的成团细胞，些许贴壁的点状杂质，换液能去除。培养第3天，细胞迅速增殖连接成片，细胞核清晰明显，细胞轮廓形状略微变模糊。培养至第4天，细胞铺满瓶底，细胞形态清晰，大小均一，呈现明显的铺路石样。AB

外源精胺对猪脐静脉内皮细胞血管形成的影响及其作用机理2.2 脐静脉内皮细胞分离免疫荧光鉴定结果细胞免疫荧光结果显示，细胞特异性表达韦伯小体蛋白 vWF 和血小板-内皮细胞粘附因子CD31多克隆抗体和Cy3标记的羊抗兔免疫球蛋白IgG染色后，在暗视野内，经过绿光激发后，显现出红色，呈阳性，细胞核 DAPI 荧光染色呈现出蓝色。明视野内，细胞呈现短梭形，成铺路石状生长。空白对照细胞不显现出红色荧光，阳性对照细胞显现出红色荧光。证明分离所获得的细胞为内皮细胞。从免疫荧光鉴定结果可以看出，细胞表现出强阳性，说明脐静脉用 I 型胶原酶 37℃下消化 15min 能获得纯度较高的血管内皮细胞。

图 2-3 脐静脉内皮细胞数与 OD 值的关系Fig 2-3 Relationship between the number of umbilical vein endothelial cells and OD图 2-4 脐静脉内皮细胞生长曲线Fig 2-4 The cell growth curve of umbilical vein endothelial
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本文编号：2859566