鸡FOXL2对卵泡颗粒细胞维持的作用及其异位表达对睾丸支持细胞的影响

发布时间：2020-10-29 14:42

　　 FOXL2是叉头状转录因子超家族的成员之一,在卵泡颗粒细胞中表达,对卵巢分化、发育和维持起重要的调控作用。在本课题组前期的研究中发现,鸡FOXL2最早在E4.5天开始表达,暗示其在鸡性别决定和性腺分化过程中可能发挥重要的调控作用;随后在成年母鸡中随着卵泡发育,FOXL2在小白卵泡中低表达、在等级前卵泡颗粒细胞表达升高、在排卵前卵泡颗粒细胞再度升高,暗示在卵泡的发育过程中,FOXL2同样可能发挥重要的调控作用;为此本研究的主要目是研究FOXL2在卵泡颗粒细胞维持中的作用,以及研究异位表达FOXL2对鸡胚睾丸支持细胞影响。研究结果如下:1.构建了具有较高过表达效率的pcDNA3.1-FOXL2过表达载体,DF-1细胞转染24 h后通过定量PCR检查FOXL2的相对过表达效率达1200多倍。2.转染pcDNA3.1-FOXL2载体后通过CCK8和ATP方法检测FOXL2对排卵前颗粒细胞(po-GC)增殖的影响。结果显示:转染pcDNA3.1-FOXL2 48h组的细胞活力显著低于pcDNA3.1组和空白组,表明过表达FOXL2抑制排卵前颗粒细胞增殖;转染48h过表达FOXL2组G1期的细胞比例显著升高,而S期和G2期细胞则显著降低以及凋亡第二和第三象限细胞比例显著性升高,说明过表达FOXL2可抑制po-GC的周期进展,促进细胞凋亡。3.为进一步了解过表达FOXL2对po-GC的促凋亡机制,通过qPCR检测凋亡TNF-α/NF-ΚB和JNK/MAPK信号通路基因,结果发现:过表达FOXL2能显著上调TNF-α、TNFSF10、FADD、BAK1、DAB21P、MAP3K7、FAS、MAP3K5、C-JUN、MAPK8、MAPK9、CASP8和CASP10等促凋亡基因,推测过表达FOXL2对排卵前颗粒细胞的促凋亡作用,主要是通过激活了JNK/TNF-α信号通路。用细胞免疫荧光检测过表达FOXL2后p65的细胞定位,结果发现离体培养的po-GC不管过表达FOXL2与否,p65均入核表达,说明此次离体培养的po-GC自主激活了NF-ΚB细胞通路。4.软件预测FOXL2是miR-1329-3p的靶基因。通过等级前颗粒细胞(ph-GC)和排卵前颗粒细胞,miR-1329-3p和FOXL2的相对定量表达模式分析,发现两者呈相反表达模式,初步推断FOXL2是miR-1329-3p的靶基因。双荧光素酶报告基因检测发现,miR-1329-3p能够与FOXL2 CDS的种子序列结合,显著性抑制FOXL2 CDS区域的报告基因活性。qPCR和Western blot研究发现,在转染颗粒细胞中,miR-1329-3p过表达能显著抑制FOXL2 mRNA及蛋白质的表达,同时抑制miR-1329-3p后的结果与过表达刚好相反。结果表明在颗粒细胞中,miR-1329-3p能通过靶向FOXL2 CDS种子序列负调控FOXL2的表达。5.在鸡睾丸支持细胞中进行FOXL2的过表达,利用放射性免疫的方法检测了细胞上清雌二醇(E2)、孕酮(P)和睾酮(T)的含量,发现E2浓度显著性上调,而P、T无显著性变化;定量PCR检测转染后性腺分化发育相关基因的表达,发现过表达FOXL2可引起睾丸分化或发育相关基因SOX9、DMRT1、STAT3表达量显著性下调,而卵巢发育相关的CYP19A1和WNT4、CTNNB1(即WNT4/β-catenin信号通路)基因显著性上调。为进一步分析WNT4/β-catenin信号通路在此过程中被激活的作用,构建了pcDNA3.1-WNT4和pcDNA3.1-CTNNB1过表达载体,发现过表达WNT4或CTNNB1,除了DMRT1不受影响,SOX9和STAT3表达量均显著下调,CYP19A1表达量显著性上调,这与FOXL2过表达作用基本一致,初步确定WNT4/β-catenin信号通路的激活同FOXL2发挥协同作用。过表达WNT4或CTNNB1后FOXL2和CTNNB1或WNT4的表达也显著性上调,这说明FOXL2,WNT4和β-catenin三者间存在互作关系。进一步分析过表达FOXL2是否是通过WNT4/β-catenin信号通路发挥作用,利用siRNA干扰β-catenin发现SOX9的表达量显著上升,FOXL2和WNT4、CYP19A1的表达量显著降低,而DMRT1和STAT3的表达无显著性变化;在过表达FOXL2同时敲低β-catenin发现,与单独过表达FOXL2组相比,共转染组SOX9的表达量显著性上调,CYP19A1表达量显著性下调,而DMRT1和STAT3表达量差异不显著,这说明过表达FOXL2对SOX9的抑制作用主要是通过WNT4/β-catenin信号通路,且该通路协同FOXL2激活CYP19A1的表达,但并非主要途径。6.构建了鸡胚E4.5-E18.5性腺FOXL2和CTNNB1的表达谱,发现FOXL2呈雌性特异性表达,且E4.5开始表达,随日龄表达量逐渐升高;CTNNB1表达不呈显著性别趋势,E4.5开始表达,推测CTNNB1在睾丸发育中同样发挥重要作用。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S831
【部分图文】：

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鸡 FOXL2 对卵泡颗粒细胞维持的作用及其异位表达对睾丸支持细胞的影响1.3 研究目的与意义FOXL2 对鸡颗粒细胞和卵巢分化具有重要的维持和分化作用，本研究旨在通过成熟颗粒细胞中过表达 FOXL2，检测对细胞增殖、周期及凋亡的影响及相关机制，进一步阐明鸡 FOXL2 对成熟颗粒细胞的维持作用；此外，研究 miRNA 对 FOXL2在颗粒细胞的调控作用，补充鸡 FOXL2 miRNA 研究的空白；同时在支持细胞中异位表达 FOXL2，旨在研究 FOXL2 对鸡胚性腺分化的影响。1.4 研究技术路线

<B pcDNA3.1(+)和 psiCHECKTM-2 载体质粒的酶切和片段回收分 别 利 用 BamH I 和 Xho I 以 及 Not I 和 Xho I 分 别 对 pcDNA3.1(+) 和psiCHECKTM-2 载体质粒进行双酶切（质粒图谱如图 2-1）：双酶切反应体系如下：10* NEBuffer 5 μLXhoI 1 μLBamH I 或 Not I 1 μLpcDNA3.1(+)或 psiCHECKTM-2 质粒 1 uL(1μg)ddH2O 42 μL总体积 50 μL37℃ PCR 仪中酶切 30min，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，检测目的片段正确后，进行回收，回收步骤参照 2.3.1.1。
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本文编号：2861045