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猪天然免疫蛋白STING结构和功能研究及CDNs免疫增强作用的筛选

发布时间:2020-11-01 07:40
   环二核苷酸中的c-di-GMP与c-di-AMP是广泛存在细菌中的第二信使。而真核细胞中,特有的cGAS酶在dsDNA存在条件下,利用ATP和GTP合成杂交的2,,3'cGAMP,其作为第二信使的发现填补了从DNA传感器到STING信号转导的空白。高等生物天然免疫系统中,细胞内STING蛋白是双链DNA引起免疫应答的重要接头分子。cGAS-STING通路在胞质双链DNA(dsDNA)检测中起着重要作用。当CDNs进入细胞内,通过STING-TBK1-IRF3信号通路产生I型干扰素,提高机体的天然免疫力。研究表明,dsDNA活化的cGAS会产生第二信使2',3'cGAMP,与c-di-GMP、c-di-AMP、3',3'cGAMP等细菌环二核苷酸(CDNs)相比,其与STING结合亲和力更强。二聚体STINGCBD优先结合不对称的2',3'cGAMP而非对称的3',3'CDNs,但STING分子采用对称的二聚体构象有效地结合其不对称配体仍是一个有待解决的问题。本研究通过改造的核苷酸环化酶DncV(VC0179),实现VC0179-△LOOP的可溶性表达。改造后的VC0179,显著提高GTP和ATP的利用率,减少酶的损耗,制备纯化了 c-di-GMP、c-di-AMP和3',3'cGAMP三种小分子。表达构建鼠源mcGAS有效片段,作为酶催化合成2',3'cGAMP小分子,成功制备了高纯度的2',3'cGAMP小分子。生化实验显示2',3'cGAMP是与猪STING具有最高结合亲和力的内源性配体,这与内源性配体与机体本身的亲和力是最强的呈一致性。2',3'cGAMP激活猪源免疫细胞产生IRF3、IFN-β的效果显著。本研究借助X-射线晶体学的方法解析了猪源STING蛋白的C端结构域(CTD)上的STING CDN-binding domain(CBD)分别与第二信使 c-di-GMP、c-di-AMP、3',3'cGAMP 和 3',3'cGAMP 形成复合物(1.76-2.6 A)的三维空间结构,结果表明2',3'cGAMP与猪STING的亲和力远高于其他c-di-GMP、c-di-AMP和3',3'cGAMP五个小分子。对猪STINGCBD-CDNS复合物的结构研究表明,猪STINGCBD可以形成不对称的配体结合口袋来容纳CDNs。非对称的2',3'cGAMP和配体结合口袋之间的广泛的相互作用和形状互补使其成为猪STING最易结合的配体,而几何约束限制了对称的3',3'CDNs和猪STING之间的结合。总之,明确了猪STING采用不对称构象识别不对称的小分子,确定配体结合和识别的结构基础,为解析猪STINGCBD-CDNs复合物的结构研究提供了一个新的视角,这对激活和调节cGAS-cGAMP-STING途径具有重要意义,进一步确认了 cGAS-STING通路的激活机制及其在抗病毒防御中的作用。致病性结核分枝杆菌编码两种DtxR家族金属调节剂,IdeR和MntR。IdeR抑制铁对基因表达的响应,MntR(Rv2788)作为一种锰依赖的转录抑制因子,抑制锰转运蛋白基因的表达,维持锰的稳态。虽然对IdeR的结构研究比较深入,但目前还没有MntR结构。在此,我们报告了结核分枝杆菌MntR结构的apo和锰结合的两个晶体结构。MntR已经演变成和其他DtxR蛋白质一样的有两个金属离子结合位点。我们首次捕获了两个完全被其天然离子占据的位点。第一个位点有一个Mn2+离子,第二个结合位点有两个Mn2+(双核锰群集)。锰结合所引起的MntR构象的改变可以使MntR与DNA结合,这是DtxR家族中保守的活化机制。
【学位单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2019
【中图分类】:S852.4
【部分图文】:

信号通路,受体,环鸟苷酸,干扰素


?山东大学博士学位论文器分子(MAVS)相互作用。??而胞质内DNA的受体识别是研究发现DNA胞膜受体——Toll样受(tolWikereceptor9TLR9)之后[3],陆续发现数种DNA胞质受体,如DNA依赖扰素调节因子激活物(DAI)[1G]、RNA?聚合酶?III(RNApolymerase?III,Pol?III)、AI样蛋白(AIM2-like?receptors,ALR)家族、富亮氨酸重复序列相互作用(Leucine-rich?repeat?flightless-interacting?protein?1,?LRRFIP1?)、DEx?D?/?H?解旋族、DNA依赖性蛋白激酶(DNA?dependent?protein?kinase,DNA-PK)、干扰素刺因(stimulator?of?interferon?gene,STING)、环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic?GMP-Asynthase,cGAS)、DNA?修复相关蛋白?Rad50?及转录因子?Sox2(sry-relatedHMG2)[3.5]等。??下面着重介绍dsDNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶CGAS与干扰素刺因(stimulator?of?interferon?gene,?STING)的天然免疫信号通路。??

信号通路,抗病毒免疫,成病,间隙连接


cGAS和STING还可以跨不同的细胞协作,以水平方式传播抗病毒免疫应答。这??种转移过程要么依赖于cGAMP的间隙连接依赖传递,要么通过将cGAMP打包成病??毒颗粒(图2)[27-29]。总之,通过DNA检测,cGAS产生cGAMP,激活STING。激活??后,STING退出内质网,加入TBK1和IRF-3。磷酸化的IRF-3二聚并转位到细胞核??10??

蛋白,基因序列


改造后的VC0179-ALOOP基因序列:??atgagaatga?cttggaactt?tcaccagtac?tacacaaacc?gaaatgatgg?cttgatgggc?60??aagctagttc?ttacagacga?ggagaagaac?aatctaaagg?cattgcgtaa?gatcatccgc?120??ttaagaacac?gagatgtatt?tgaagaagct?aagggtattg?ccaaggctgt?gaaaaaaagt?180??gctcttacgt?ttgaaattat?tcaggaaaag?gtgtcaacga?cccaaattaa?gcacctttct?240??gacagcgaac?aacgagaagt?ggctaagctt?atttacgaga?tggatgatga?tgctcgtgat?300??gagtttttgg?gattgacacc?tcgcttttgg?actcagggaa?gctttcagta?tgacacgctg?360??aatcgcccgt?ttcagcctgg?tcaagaaatg?gatattgatg?atggaaccta?tatgccaatg?420??cctatttttg?agtcagagcc?taagattggt?cattctttac?taattcttct?tgttgacgcg?480??tcacttaagt?cacttgtagc?tgaaaatcat?ggctggaaat?ttgaagctaa?gcagacttgt?540??gggaggatta?agattgaggc?agagaaaaca?catattgatg?taccaatgta?tgcaatccct?600??a

本文编号:2865227

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