布鲁氏菌S2-BCSP31缺失疫苗株的构建及免疫效果初步评价

发布时间：2020-11-01 09:06

　　 布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种严重的人畜共患传染病,在世界各地均有发生,发展中国家尤为严重。布鲁氏菌是典型的胞内寄生菌,其侵袭能力强,感染的宿主及途径广,现已知能够感染布鲁氏菌的动物多达60余种,猪、牛、羊均为易感动物,且各家畜之间存在交叉感染。近年来随着牛、羊布鲁氏菌疫情的回升,吉林省梅花鹿布鲁氏菌病时有发生,患病圈养的鹿已成为人类感染布鲁氏菌病的重要传染源之一,影响国民经济,同时给人类健康及畜牧业发展造成严重影响。预防和控制布鲁氏菌病的首要措施是减毒疫苗免疫,但疫苗免疫后持续产生抗体,常规的血清学检测方法不能区分自然感染和人工免疫动物,不利于布鲁氏菌病的防控与净化。BCSP31基因作为布鲁氏菌的保护性抗原,具有良好的免疫原性,有研究表明该基因的缺失不影响布鲁氏菌的生存,可以作为缺失株疫苗的靶基因。因此,本研究在对吉林省梅花鹿布鲁氏菌流行情况及相关风险分析的基础上,选定S2疫苗株为亲本株,构建布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株,以布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株感染巨噬细胞,分析BCSP31基因在布鲁氏菌逃避宿主免疫机制中的作用机制,并对构建的缺失株安全性及保护性进行评估;以BCSP31蛋白为包被抗原建立ELISA检测方法,对布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株作为候选疫苗株的可行性分析;以期对布鲁氏菌病的防控与致病机制提供理论基础。主要实验结果如下:1、通过虎红平板凝集试验和荧光定量PCR方法对采集的458份梅花鹿血液样本进行血清学及分子生物学检测,虎红平板凝集检测57份阳性血清,4份疑似血清;荧光定量PCR共检测59份阳性样本,总阳性率为12.9%(59/458);其中猪种布鲁氏菌27份、羊种布鲁氏菌19份、牛种布鲁氏菌13份,分析季节为梅花鹿感染布鲁氏菌的风险因素。2、以S2为亲本株,利用同源重组技术构建布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株,生物学特性鉴定证明S2-BCSP31缺失株在形态学、生长特性、生化特性等方法与亲本株保持一致;连续传20代及保存12个月后的S2-BCSP31缺失株具有良好的遗传稳定性;Western Blot鉴定表明缺失株不与rBCSP31蛋白高免血清发生反应,BCSP31蛋白在缺失株中不表达,说明S2-BCSP31缺失株构建成功。3、建立S2-BCSP31缺失株和S2疫苗株巨噬细胞体外感染模型,分析BCSP31缺失对巨噬细胞分泌炎症因子及自噬互相作用的影响,结果表明S2-BCSP31缺失株上调IL-12、IL-β的表达,下调IL-6、TNF-α炎症因子的表达,有利于LC3B、Beclin、p62、Bcl2蛋白表达。对布鲁氏菌诱导的PI3K/Akt/mTOR和MER/ERK信号通路蛋白表达分析,证实S2-BCSP31缺失株有利于PI3K/Akt/mTOR自噬途径激活。抑制该通路后自噬相关基因LC3B、Beclin及ULK的mRNA表达水平和胞内菌落数下降,证明该通路激活有利于S2-BCSP31缺失株在巨噬细胞内存活。4、免疫小鼠后,毒力残留实验结果显示S2-BCSP31缺失株与S2亲本株免疫的小鼠脾脏重量及含菌量基本吻合,证明构建的缺失株与亲本株生物安全性无差别;抗体检测和细胞因子检测结果表明S2-BCSP31缺失株与S2亲本株诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫之间差异不显著。攻毒后结果显示:S2-BCSP31缺失株能够抵抗M28、2308、1330强毒攻击,小鼠的脾脏重量及含菌量S2-BCSP31缺失株组和S2疫苗株组之间差异不显著,但与阴性对照组差异极显著(p0.01),证明S2-BCSP31缺失株与S2疫苗株在短期内产生的免疫保护力一致,布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株具有良好的潜力。5、以rBCSP31蛋白为抗原建立ELISA检测方法,结果表明M28、1330、2308攻毒及S2疫苗株免疫小鼠血清呈阳性,S2-BCSP31缺失株免疫小鼠血清呈阴性,证明该方法能够区分S2-BCSP31缺失株免疫及其他自然感染的血清,为建立与标记疫苗配套的检测方法奠定理论和实践基础。综上所述,本研究构建的布鲁氏菌S2-BCSP31缺失株具有良好安全性及保护性,具备从血清学角度区分布鲁氏菌S2-BCSP31及野毒感染的能力,作为疫苗有良好的应用前景,对布鲁氏菌病防制、监测、净化及致病机制研究具有重要的意义。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

胞内扩散均具有重要的意义。1.3.2 布鲁氏菌与自噬1.3.2.1 细胞自噬自噬是 1962 年由 Ashford 和 Porten 首次提出的，对于细胞中存在的自食象被称为自噬。其是指源于粗面内质网的无核糖体附着区的双层膜结构，包裹老化的细胞器、错误折叠的蛋白质以及部分胞质形成自噬体（autophagiosome其能够与溶酶体融合，形成自噬溶酶体并对内含物进行降解，以实现细胞本身代谢需要以及某些细胞成分的更新，在细胞生长、发育以及一些疾病中发挥重作用。自噬的发生经过四个阶段（图 1）：自噬膜的形成、自噬体的形成、自噬的运输融合及自噬体的降解。具体过程为：细胞接收到自噬诱导的信号后会在浆处形成一个自噬膜结构；然后将需要降解的部分包裹在膜内形成一个密封的状自噬体；自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后依靠溶酶体的酸性降解降解包裹得到物质。此过程对细胞自身的组成成分的分解及再利用、清除入侵病原菌、维持细胞的稳态具有重要作用。

自噬信号通路Fig.2Autophagysignaling

图 1-1 IS711 通用引物荧光定量 PCR 检测结果Fig.1-1 Results of Fluorescence quantitative PCR by IS711primer1.3.3 BMEII0466 引物荧光定量 PCR 检测结果利用羊种引物（BMEII0466）及探针对通用型引物（IS711）检测出的阳性基因组样本进行进一步分型鉴定，结果显示通用型引物（IS711）检测出的 59 份布鲁氏菌阳性样本中羊种布鲁氏菌占有 19 份。检测结果如图 1-2 所示：图 1-2 BMEII0466 引物荧光定量 PCR 检测结果Fig.1-2 Results of Fluorescence quantitative PCR by BMEII0466 primer1.3.4 BruAb-0168 引物荧光定量 PCR 检测结果
【参考文献】

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本文编号：2865319