DAP12在PRRSV抑制宿主细胞天然免疫应答中的作用机制研究

发布时间：2020-11-02 05:38

　　 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称猪蓝耳病,是一种高度接触性传染病。该病具有高发病率、高致死率和持续性感染的特点,是危害世界养猪业头号疫病之一。造成PRRS持续性感染的因素很多,其中一个重要原因是其病原PRRSV(PRRS virus)进化出多种策略拮抗宿主细胞天然免疫应答,包括抑制I型干扰素(type I interferons,type I IFNs)表达和推迟高水平促炎细胞因子诱导产生等。DNAX激活蛋白12(DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12)是免疫细胞中重要接头蛋白。DAP12通常被相关受体募集活化,进而招募并激活下游分子,从而介导不同的免疫学功能。本课题主要围绕“DAP12在PRRSV调节宿主细胞抗病毒天然免疫应答的作用机制”开展研究。研究内容主要分为以下三方面:第一部分DAP12在PRRSV调节宿主细胞天然免疫应答中的功能本章节研究中,首先在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中敲低DAP12,发现能增强PRRSV诱导I型干扰素和促炎细胞因子转录,干扰素调控因子-3(IFN regulatory factor 3,IRF-3)磷酸化水平也明显提高;在CRL-2843-CD163细胞中过表达DAP12则会抑制上述细胞因子转录活化。进一步探索PRRSV是否利用DAP12-脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)信号通路抑制宿主细胞抗病毒促炎细胞应答,发现PRRSV感染增强DAP12-Syk通路活化(包括二者磷酸化及相互作用),敲低Syk或抑制Syk活性会增加PRRSV激发促炎细胞因子的产生。接下来,研究了PRRSV感染中,DAP12-Syk通路对炎症通路活化的影响。结果表明,在PAMs中敲低DAP12能增强PRRSV诱导ERK1/2、p38、NF-κB的活化;在CRL-2843-CD163细胞中,过表达DAP12能抑制PRRSV激活的NF-κB通路(MAPKs通路的活化不受影响)。而在敲低Syk的细胞中,DAP12过表达不能发挥抑制功能。上述结果表明,PRRSV能够利用DAP12拮抗IRF-3介导的IFNs应答以及NF-κB介导的促炎细胞应答。这些发现有助于加深对PRRSV致病机制的了解。第二部分NMHC-IIA-DAP12在PRRSV抑制宿主细胞抗病毒炎症应答的作用机制研究非肌肉肌球重链蛋白IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA,NMHC-IIA)是非肌肉肌球蛋白IIA(non-muscle myosin IIA,NM-IIA)亚基,参与细胞迁移、形态维持以及信号转导等众多重要生理学过程。此前研究表明NMHC-IIA可以参与PRRSV对细胞入侵。本章节首先通过免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)及质谱(mass spectrometry,MS)分析鉴定出NMHC-IIA是PRRSV感染早期DAP12显著结合蛋白。随后通过Co-IP和激光共聚焦显微术确定了PRRSV感染促进NMHC-IIA-DAP12-Syk三元复合物的形成。根据DAP12免疫接头蛋白的特性,NMHC-IIA可能作为受体通过偶联DAP12发挥免疫调节功能,因此下一步确定NMHC-IIA在PRRSV感染早期的作用及其作用机制。进一步利用pulldown证实,NMHC-IIA和DAP12互作依赖于NMHC-IIA羧基端非螺旋区和DAP12跨膜区50-57位氨基酸的结合。随后发现,NMHC-IIA通过识别PRRSV糖蛋白5(glycoprotein 5,GP5)表面唾液酸修饰活化DAP12-Syk通路,抑制NF-κB/MAPKs通路介导的促炎细胞应答。利用另一种唾液酸修饰RNA病毒-水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)证实该病毒可以被NMHC-IIA识别,从而激活DAP12-Syk通路抑制宿主细胞促炎细胞应答的发生。以上结果揭示出唾液酸化修饰RNA病毒利用NMHC-IIA-DAP12-Syk通路拮抗宿主抗病毒免疫反应的新策略。更重要的是,唾液酸类似物同样可以激活该通路抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下NF-κB介导的炎症应答。NMHC-IIA对炎症应答的负调控可能是免疫细胞中普遍存在的调节机制,是机体维持稳态的重要手段之一,也可能是新的潜在抗炎药物靶点。第三部分poSn-DAP12在PRRSV抑制宿主细胞I型干扰素应答中的作用机制研究猪唾液酸黏附素(porcine sialoadhesin,poSn)也被称为唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin-1,Siglec-1),曾被认为是PRRSV入侵宿主细胞的关键受体之一。最近有报道称poSn基因敲除猪对PRRSV仍易感,提示poSn可能在PRRSV感染中发挥其他作用。本章节研究发现,PRRSV感染晚期通过IFN-信号转导子和转录激活子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)通路诱导poSn上调。poSn随后抑制PRRSV感染中I型干扰素的产生。进一步研究表明,PRRSV感染能增强poSn和DAP12的相互作用,poSn-DAP12通路参与拮抗NF-κB和IRF-3介导的IFNs应答。本研究从一个全新的角度重新解释了poSn在PRRSV感染中的作用。综上所述,PRRSV感染中DAP12作为重要的免疫接头蛋白,偶联不同的受体蛋白,参与对宿主细胞抗病毒天然免疫应答的抑制。其中,在PRRSV感染早期,NMHCIIA通过识别病毒表面唾液酸修饰,募集并活化DAP12-Syk通路,抑制抗病毒炎症反应;在PRRSV感染晚期,poSn通过偶联DAP12参与拮抗抗病毒干扰素应答。此外,NMHC-IIA-DAP12-Syk通路抑制LPS激活的促炎细胞应答;poSn-DAP12通路抑制poly(I:C)诱导的I型干扰素的产生。这些发现扩展了对宿主细胞天然免疫应答负调控机制的理解,为PRRSV及其它唾液酸化RNA病毒的防控提供新的理论依据。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

图 1-2 PRRSV 抑制 I 型干扰素应答Figure1-2 PRRSV inhibits type I IFN responses (Sun, Han et al. 2012)1.1.2.2 PRRSV 拮抗宿主促炎细胞应答促炎细胞应答作为天然免疫应答重要的组成部分，可以抑制病毒复制并阻止其机会致病菌的“趁虚而入”(Medzhitov 2010)。病毒入侵细胞会引起 NF-κB 和 ERK1/2p38 和 JNK MAPK 等蛋白激酶的活化，最终诱导白介素（interleukin，IL）-6、IL-8IL-1β 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等促炎细胞细胞因子的大量生。PRRSV 在猪体内感染会推迟促炎细胞应答的发生，具体表现为猪在感染 PRRS后第七天才检测到高水平炎症因子的释放。这提示，PRRSV发挥抑制炎症反应的作用帮助病毒持续感染的建立 (Gomez-Laguna, Salguero et al. 2010, Zhang, Liu et al. 2013)例如，体内试验发现，PRRSV 能够抑制猪体内 TNF-α 的分泌 (Gomez-Laguna,Salgueet al. 2010)。体外试验则证明，PRRSV 抑制 LPS 和佛波酯（phorbol myristate acetatePMA）诱导 TNF-α 的产生 (Lopez-Fuertes, Campos et al. 2000, Hou, Wang et al. 2012)在浆细胞样树突状细胞（plasmacytoiddendriticcells，pDCs）中，PRRSV 同样可以选

PRRs之间的交互调节(引自(TakeuchiandAkira2009))

图 1-8 常见的 CLRs（引自(Brown, Willment et al. 2018)）Figure 1-8 Representative C-type lectins (Brown, Willment et al. 2018)CLRs 介导通路的活化主要依赖于免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM）。ITAMs 可以作为某些 CLR（比如 dectin1 和DNGR1）的胞内尾巴直接传递信号；也可以存在于信号通路接头蛋白中接收来自 CLRs的信号。例如含有 ITAM 基序的 Fc 受体 γ-链（Fcreceptorγ-chain，FcRγ）可以被 dectin2、巨噬细胞 C 型凝集素（macrophageC-typelectin，MCL）或巨噬细胞可诱导 C 型凝集素（macrophage-inducible C-type lectin，mincle）所募集；人源 DAP10 或鼠源 DAP12 则可以被 CLEC5A、肝脏和淋巴窦内皮细胞 C 型凝集素（liver and lymph node sinusoidalendothelialcellC-typelectin，LSECtin）或 NKG2D 等 CLRs 所募集。在骨髓细胞中，这些 ITAMs 能够募集 Syk（在 T 细胞中则是募集酪氨酸蛋白激酶（tyrosine-proteinkinase，ZAP70 ））， 随 后 诱 导 接 头 蛋 白 CARD9-B 细 胞 淋 巴 瘤 / 白 血 病 10 （ B-celllymphoma/leukemia 10，BCL-10）-粘膜相关淋巴组织淋巴瘤转位蛋白 1（mucosa-associatedlymphoidtissuelymphomatranslocationprotein1，MALT1）复合物的形成，最
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本文编号：2866642