猪嵴病毒RPA快速诊断方法的建立和应用

发布时间：2020-11-01 19:03

　　 猪嵴病毒(Porince Kobuvirus,PKV)是引起猪腹泻的一种常见的肠道病毒,其中1周龄以内仔猪易感率最高。感染猪群主要表现为精神萎靡、水样腹泻等临床症状,严重时可导致脱水甚至死亡。目前,PKV的临床诊断主要依靠于RT-PCR方法,但该检测方法的灵敏度有限,毒量较低的样品不能准确检出,容易出现漏检。因此,建立一种具有更高敏感性、特异性以及快速检测的临床诊断方法就显得格外重要。本研究以Basic RPA和LF-RPA为基础,结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析免疫技术,建立了PKV的临床快速检测方法,为今后PKV的临床诊断及快速检测提供了新的技术手段。具体试验结果如下:1.猪嵴病毒Basic RPA快速诊断方法的建立根据GenBank中公布的猪嵴病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)基因组序列设计并合成Basic RPA特异性引物,构建PKV阳性质粒标准品,以阳性标准品为模板建立检测PKV的重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法,并对此方法的敏感性、特异性以及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板时均未检测到特异性扩增条带,而用不同浓度的质粒标准品进行重复试验时,均能扩增出特异性条带,该方法可检测的最低限度为3.36×10~2copies/μL。上述结果表明,本研究成功建立了一种具有较高特异性、重复性和敏感性的PKV Basic RPA快速检测方法。2.猪嵴病毒LF-RPA快速诊断方法的建立根据GenBank中已公布的猪嵴病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)基因组序列设计并合成LF-RPA特异性引物和探针,构建PKV阳性质粒标准品,以质粒标准品为模板建立LF-RPA快速检测方法,并对该方法的特异性、重复性、敏感性进行了评价。结果显示,以TGEV、PEDV、FMDV、PRRSV、PDCoV为模板时试纸条均无检测条带出现,测试结果呈阴性,证明该检测方法具有很好的特异性。用不同浓度的质粒标准品进行重复实验,试纸条均出现检测条带,测试结果呈阳性。其检测的最低限度为3.36×10~2copies/μL。上述结果表明,本研究成功建立了一种具有较高特异性、重复性、敏感性的PKV LF-RPA快速检测方法。3.猪嵴病毒Basic RPA和LF-RPA检测方法的临床应用利用本研究建立的快速检测方法对2016—2017年从河南、新疆、黑龙江等地采集的276份猪粪便样品进行检测,同时利用常规的RT-PCR方法进行对照检测。结果显示,常规RT-PCR方法检测出140份阳性样品,阳性检出率为50.7%,而利用本研究建立的Basic RPA方法检测出162份阳性样品,阳性检出率为58.7%;利用LF-RPA方法检测出154份阳性样品,阳性检出率为55.8%。此外,本研究建立的两种检测方法操作简便,相较于常规RT-PCR更节省时间,适用于临床大规模样品检测。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

36×104copies/μL。图 3： RT-PCR 的检测灵敏度结果Figure 3: Sensitivity results of RT-PCRNC:阴性对照 NC:Negative control特异性引物进行RT-PCR扩增时，从琼脂现良好的特异性扩增条带，因此，可以证

3.2 敏感性试验3.2.1 PKV 阳性标准品 Basic RPA 反应的灵敏性从图2中可以看出当阳性质粒标准品的拷贝数在3.36×108-3.36×102copies/μL范围内均能检测到特异性扩增条带，而且在 3.36×108copies/μL 时扩增条带最亮，在 3.36×102copies/μL 时扩增条带最弱，因此，可以确定的是，利用此方法得到的最低检测限度为 3.36×102copies/μL。扩增结果符合浓度梯度，而 3.36×101copies/μL 和对照组均未出现特异性扩增条带。

NC:阴性对照 NC:Negative control3.2.2 PKV 阳性标准品 RT-PCR 反应的灵敏性从图3可以看出当阳性质粒标准品的拷贝数为3.36×104copies/μL 时能检测到扩增条带，而在更低浓度和对照组均无特异性扩增，表明利用该检测方法得到的最低检测限度是3.36×104copies/μL。图 3： RT-PCR 的检测灵敏度结果Figure 3: Sensitivity results of RT-PCRNC:阴性对照 NC:Negative control3.3 特异性试验当以6种病毒各自特异性引物进行RT-PCR扩增时，从琼脂糖凝胶电泳图上可以看出，6种病毒均出现良好的特异性扩增条带，因此，可以证明6种病毒均为阳性毒株。图4：RT-PCR特异性检测结果Figure 4: Specificity results of RT-PCR
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本文编号：2865956