塞内卡谷病毒分离鉴定及其3C蛋白酶拮抗干扰素产生的分子机制

发布时间：2020-11-02 06:42

　　 塞内卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属成员,与心肌炎病毒属成员的遗传关系最近。近年发现SVV与猪特发性水疱病(Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)和流行性新生儿暂时性死亡(Epidemic transient neonatal losses,ETNL)等新病原相关,感染猪临床表现为跛行,水疱并伴有精神沉郁、厌食,新生仔猪病死率高达30%~70%。自2014年以来,在全球多个国家报道了SVV感染所致PIVD的病例。我国广州一家猪场首次报道SVV感染,随后在湖北、黑龙江、河南、福建和广东等地陆续出现SVV感染病例。作为猪新发的传染病病原,目前对其与宿主的抗病毒相互作用关系知之甚少。SVV是如何导致猪体发病,急需从各个层面进行解析其致病机理。鉴于此,本研究从病毒的分离鉴定、SVV感染性克隆的构建以及SVV对宿主抗病毒天然免疫的调控三方面进行了研究。具体内容如下:1.SVV的分离与鉴定从临床疑似SVV感染的特发性水疱病仔猪中采集水疱液,对可造成猪只水疱性疾病的重要病原,如水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV),口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪水疱病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)进行病原特异性PCR检测,结果扩增出特异性目的带,测序结果表明与SVV高度同源,表明该临床病例由SVV感染导致。随后,利用BHK-21细胞对SVV进行病毒分离,获得了可引起BHK-21细胞发生典型细胞病变,在感染BHK-21细胞48小时后可产生直径为1~3毫米的病毒噬斑,利用SVV VP1蛋白多克隆抗体对病毒样品进行免疫荧光和蛋白印记检测,结果均显示为VP1反应阳性。在电子显微镜下可以观察到直径为26-30 nm无囊膜的病毒粒子。综合这些结果表明我们分离到的病毒为SVV,并命名为SVV HB-CH-2016。在获得SVV HB-CH-2016后,我们设计多条特异性的引物进行其全基因组扩增,将扩增的片段亚克隆入p Easy-Blunt载体中进行测序。结果表明,SVV HB-CH-2016全长基因组为7300 bp,包括668 bp的5￠非编码区,一个编码2181个前体多聚蛋白的开放阅读区以及86 bp具有poly A特性的3￠非编码区。全基因组已提交于Gene Bank,登录号为KX377924。2.CMV启动子驱动的SVV感染性克隆的建立本研究中以p Bluescript SKⅡ为载体,建立了由CMV启动子介导转录的SVV HB-CH-2016株的感染性克隆质粒,命名为p SKⅡ-CMV-SVV/HB。转染质粒p SKⅡ-CMV-SVV/HB于293T或BHK-21细胞,36小时后可观察到类似SVV感染的细胞病变效应。免疫荧光检测、蛋白印记和特异性PCR进行检测。结果表明,成功地拯救出SVV(r SVV)。病毒噬斑检测结果表明r SVV和野生型SVV在BHK-21细胞上产生的噬斑大小无差异。上述结果表明成功建立了CMV驱动的SVV感染性克隆平台,为SVV相关病毒特性、病毒载体和新型病毒疫苗等研究奠定了基础。3.SVV感染负调控Ⅰ干扰素的产生本研究首先利用双荧光素酶活性报告系统和实时荧光定量PCR探究了SVV感染对干扰素产生的影响,结果发现SVV感染不能激活干扰素IFN-b启动子活性和IFN-bm RNA的产生。通过对IRF3活性的检测也发现SVV不能有效的诱发IRF3发生磷酸化以及细胞核转运。此外,IFN-b处理实验结果发现,IFN-b可显著抑制SVV的增殖。以上结果表明,SVV是一个干扰素敏感的病毒,但是SVV感染不触发宿主干扰素产生应答。这暗示,SVV可能通过某种机制逃避宿主的抗病毒免疫应答。4.SVV 3Cpro负调控宿主Ⅰ型干扰素的产生构建SVV蛋白的表达质粒,利用双荧光素酶活性报告系统和实时荧光定量PCR探究了SVV感染对干扰素产生的影响。结果显示SVV VP2,3Cpro和3D均不同程度抑制了Sev对IFN-b启动子的激活,3Cpro抑制效应极显著(P0.001)。实时荧光定量PCR检测、IRF3核转运、磷酸化IRF3蛋白水平等证实SVV 3Cpro对IFN-b产生的负调控作用。以上结果证实,SVV 3Cpro能有效拮抗宿主Ⅰ型干扰素的产生。5.SVV 3Cpro靶向拮抗Ⅰ型干扰素产生的分子机制通过双荧光素酶系统检测IFN-β的启动子活性,发现SVV 3Cpro效应区间位于RIG-1/MDA-5通路与IRF3上游之间。将天然免疫信号通路相关接头分子分别与SVV HA-3C共转染293T细胞,Western blot结果表明,SVV 3Cpro特异性切割MAVS,TRIF和TANK。蛋白降解途径相关抑制剂MG132、NH4Cl和Z-VAD-FMK均不能抑制SVV 3Cpro对MAVS、TRIF和TANK的切割效应。酶活性缺失突变体结果显示SVV 3Cpro对MAVS、TRIF和TANK切割效应依赖其蛋白酶活性。免疫共沉淀(Co-IP)和细胞内激光共聚焦观察定位分析结果显示SVV 3Cpro与MAVS,TRIF和TANK存在相互作用。依据SVV 3Cpro裂解病毒多聚前体蛋白的识别位点,构建了MAVS、TRIF和TANK的一系列潜在切割位点突变体,Western blot检测对各个蛋白的切割情况。结果显示SVV 3Cpro分别在Q148和Q159氨基酸残基切割MAVS和TRIF,而在E272和Q291对TANK进行了两次切割。上述结果表明,MAVS、TRIF和TANK的切割位点突变体可抵御SVV 3Cpro的切割效应,保持其对IFN-b的激活作用;而MAVS和TANK的任何切割产物都失去了对IFN-b的激活作用;TRIF切割后其N端产物失去激活IFN-b产生的作用,但其C端产物仍然具有活性。此外,SVV感染后可上调NF-kB信号通路依赖的炎性细胞因子IL-6和TNFam RNA的转录。SVV 3Cpro的表达可增强Sev感染对NF-kB信号通路的激活作用。SVV 3Cpro介导的TANK切割可促进TRAF6诱导的NF-kB信号通路的激活。综上所述,本研究从临床疑似PIDV病例中分离一株SVV;建立了SVV的感染性克隆;证实SVV 3Cpro通过特异性切割宿主抗病毒天然免疫相关重要接头分子MAVS、TRIF和TANK,负调控Ⅰ型干扰素的产生,从而逃避宿主的抗病毒免疫。3Cpro对TANK的切割也促进了TRAF6介导的NF-kB信号通路的激活,这与SVV感染激活宿主NF-kB信号通路,诱发炎性细胞因子的产生存在重要相关性。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

图 1-1 小 RNA 病毒分类Fig. 1-1 Classification of small RNA virus(ICTV, 2018)病毒颗粒呈球形，二十面体衣壳围绕裸 RNA 基因组。壳体由 60 个原子密二十面体排列组成，每个由长度分别为 265、286、241 和 74 个残基的四个 VP1，VP2，VP3 和 VP4 组成，VP4 位于衣壳的内侧。SVV 具有疏水口袋口袋因子(Venkataraman et al 2008b)。病毒颗粒直径约 26-30nm。病毒粒子件下更具稳定性，pH 值≤5.5 时分解为五聚体亚基(Strauss et al 2017)。

图 1-1 小 RNA 病毒分类Fig. 1-1 Classification of small RNA virus(ICTV, 2018)颗粒呈球形，二十面体衣壳围绕裸 RNA 基因组。壳体由 60面体排列组成，每个由长度分别为 265、286、241 和 74 个残，VP2，VP3 和 VP4 组成，VP4 位于衣壳的内侧。SVV 具有因子(Venkataraman et al 2008b)。病毒颗粒直径约 26-30nm。更具稳定性，pH 值≤5.5 时分解为五聚体亚基(Strauss et al 2

图 1-3 SVV 基因组模式图Fig.1-3 Schematic diagram of the SVV genome(ViralZone, 2010)1.1.1.2.1 5’UTR 和 3’UTRSVV 5’UTR 的一部分碱基（nt406-625）与丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）具有 57.3%的核苷酸序列同一性，表明 SVV 可能含有一个 IV 型内部核糖体进入位点（Internal ribozyme entry site, IRES），其功能是允许通过抑制细胞 RNA 的翻译来独立翻译病毒 RNA。随后，研究学者对包括各种黄病毒、小核糖核酸病毒和 SVV的二级结构的分析预测，支持了 SVV IRES 是 IV 型的假说(Flather and SemLer 2015;Martinez-Salas et al 2015)。SVV IRES 与 HCV 和猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）的 IRES 关系密切可能是基因组之间发生独立的重组(Willcocks et al 2011)。通过对 SVV 5’UTR 的 1-400 nt 的分析预测，显示其有一个高水平的二级结构，包括7 个简单的和 2 个复杂的茎环结构(Hales et al 2008)。SVV 基因组 RNA 在其 5'端共价连接一个病毒蛋白 VPg（virio protein），而不是甲基化的核苷酸帽结构，这对起始病毒 RNA 合成起着重要的作用。
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本文编号：2866707