鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究

发布时间：2020-11-03 02:17

　　 鸡病毒性传染性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis,TVP)主要引起鸡的消瘦、粪便过料、腺胃肿大等症状。该病最早在1978年由荷兰科学家Kouwenhoven发现,并蔓延至全世界各个国家。中国在1994年的江苏省最先出现,随后在全国各省市呈爆发式流行。该病能够显著增加料肉比,降低鸡肉的产量,给肉鸡养殖业带来巨大的经济损失,已成为困扰肉鸡养殖业的重要问题。尽管国内外众学者分离到多种相关病毒,如网状内皮增生症病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、呼肠孤病毒、J亚群禽白血病病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒、腺胃坏死病毒等,但均无法使用纯病毒复制出该病,因此,鸡TVP的病因一直未明。根据大量流行病学调查结果及前人的研究,我们推测该病是由一种未知的新病毒引起。为了鉴定此未知病毒,本研究通过深入流行病学调查,排除现有已知的TVP相关病毒,筛选典型单感染TVP病例,建立TVP疾病模型,利用PacBio三代测序平台进行病毒宏基因组高通量测序,分离鉴定病毒,进而研究病毒的致病机制。为临床生产提供理论指导和技术支撑。为了获得无现有已知TVP相关病毒感染的单纯TVP病例,本研究通过流行病学调查,采集了80多个TVP发病鸡场的336份样品,通过大体剖检及病理组织学检测,对发病类型进行归纳总结,利用病理学方法进行分类。从中筛选出病理组织学病变为黏膜层和腺管间淋巴细胞浸润的TVP病例。通过PCR检测排除上述已知8种腺胃炎相关病毒的感染,并且接种营养肉汤培养基排除细菌感染。为排除无关病毒的干扰,确保后续病毒鉴定的准确性。本研究以筛选出的病例的病料为原始材料回归SPF鸡,成功复制出TVP疾病模型,感染鸡表现表现出典型TVP症状。再次对回归动物进行已知腺胃炎相关病毒的PCR检测,检测结果显示8种已知TVP相关病毒均为阴性,排除已知相关病毒污染。为了鉴定病毒,首先通过电镜观察到病毒粒子的大小和形态,发现病毒粒子呈圆形或二十面体对称,无囊膜,直径为26-28 nm。使用PacBio三代测序平台进行病毒宏基因组高通量测序,并与2017年NCBI最新病毒库进行BLAST比对。比对上的序列均显示同一种病毒-圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)。使用反向PCR扩增病毒全长序列,最终得到病毒的全长序列为2356 bp,将其命名为SDAU-1株。GyV3-SDAU-1株基因组中含有3个重叠的开放阅读框,编码三种蛋白,分别为衣壳蛋白VP1,骨架蛋白VP2,凋亡蛋白VP3。NCBI查找圆环病毒科和细环病毒科共30株病毒全基因组序列构建系统发育进化树,结果显示GyV3-SDAU-1与GyV3-FecGy同源关系最近,属于细环病毒科圆圈病毒属。GyV3为单链环状DNA病毒,2012年首次在智利和香港发生急性胃肠炎的儿童粪便中分离鉴定,说明该病毒与胃肠炎关系密切,本研究首次从发生TVP的商品肉鸡中检测到GyV3,证实GyV3来源于鸡。根据柯赫氏法则,需证明GyV3是否是引起TVP的主要原因。首先对采集的336份TVP病例和102份正常鸡样品,进行了回顾性流行病学调查。结果显示,336份腺胃炎病例中GyV3阳性率为12.5%(42/336),在正常鸡中未检测到GyV3(0/102)。表明GyV3在TVP病例中普遍存在,而在健康鸡体内不存在。为了纯化GyV3,体外培养鸡胚腺胃原代细胞,并将GyV3感染鸡腺胃组织处理后接种于鸡胚腺胃原代细胞。收集接种GyV3的细胞,通过电子显微镜可以观察到GyV3粒子,PCR检测显示GyV3为阳性,8种已知腺胃炎相关病毒均为阴性,说明病毒可以在腺胃原代细胞中复制,并且未污染其他病毒。然后将纯培养的GyV3接种1日龄SPF鸡,接毒鸡表现消瘦、腺胃肿大、腺胃乳头肿胀、腺胃黏膜层和固有层大量淋巴细胞浸润,呈现典型的TVP症状,并且从发病鸡中能够再次分离到GyV3,证明GyV3确实能够引起鸡的TVP。为明确GyV3的致病性及发病规律,将腺胃原代细胞培养的GyV3接种SPF鸡,通过大体剖检观察和病理组织学观察病变情况,表明鸡腺胃组织从7日龄开始出现明显炎症,14-21日龄之后达到高峰,35日龄症状减轻,这与临床生产中鸡TVP的发病日龄吻合。接毒鸡除表现典型的TVP症外,还引起鸡的贫血和免疫抑制症状。为明确GyV3的可能感染途径,通过腹腔、静脉、皮下、口服注射4种不同方式接种SPF鸡,发现不同接种方式均表现出相同的病理变化和病程变化。说明GyV3可以经多种途径感染。为明确GyV3对不同日龄SPF鸡的感染力,将GyV3接种不同日龄(7日龄、14日龄、21日龄、28日龄)SPF鸡,结果显示,不同日龄的鸡均表现出相同的病理变化和病程变化,说明鸡只对GyV3无日龄抗性,即GyV3可感染不同日龄的鸡只。为了探究GyV3的发病机制,本研究研究通过绝对荧光定量PCR检测8个时间段,29种鸡组织器官内的病毒含量。结果显示,病毒含量最高的组织为肾上腺、骨髓,其次是神经、卵巢和羽髓,而腺胃的病毒载量则相对较低。肾上腺和神经高病毒含量表明其引起腺胃炎的原因可能是间接的,病毒入侵肾上腺和神经后,导致体液调节和神经调节的腺胃出现炎症。而骨髓作为最大的造血器官,病毒入侵后,导致造血干细胞及早期免疫细胞发育不良,造成贫血和免疫抑制。为探索GyV3发病的分子机制,以GyV3的主要结构蛋白VP1构建真核表达载体并转染细胞,通过免疫共沉淀联合质谱分析技术分析与其互作的宿主蛋白,结果显示,信号转导和转录激活子3、T细胞受体、胱天蛋白酶募集域蛋白9和酪蛋白激酶1四种蛋白可能分别参与了病毒入侵机体及逃避宿主免疫、机体对病毒的识别和信号传递、激活先天性免疫和特异性免疫等过程,说明GyV3感染改变了细胞的生物进程,激活或抑制了一系列信号通路。综上所述,本研究在大量临床调查的基础上,利用病毒宏基因组高通量测序的方法从无现有TVP相关病毒感染的、单纯TVP病例中分离鉴定出一种新病毒,GyV3。并使用纯培养的GyV3复制出TVP,证明GyV3是引起鸡TVP的直接病因,同时GyV3也能够引起贫血和免疫抑制。而GyV3诱导腺胃炎的原因可能是GyV3感染肾上腺和骨髓间接引起。此外,GyV3的结构蛋白VP1主要通过信号转导和转录激活子3、胱天蛋白酶募集域蛋白9、酪蛋白激酶1和T细胞受体四种蛋白与宿主细胞发生互作以改变宿主细胞的生物进程。我们的研究为后续GyV3的致病机制研究和TVP的防控提供了科学基础。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：

1.3.1 临床症状腺胃炎主要能够影响鸡群的生长性能。发病鸡主要表现为精神沉郁、少食少水、体型消瘦、体重下降（图1）(Goodwin et al., 1996)；在疾病中后期，发病鸡还会表现出严重的腹泻，且粪便中掺杂有大量的未消化的饲料(GR et al., 2001)；此外，发病较严重的鸡的体重下降十分明显、全身苍白、体态差，最终可能会衰竭而亡(Goodwin et al.,1996;Huff et al., 2001)。图1 受腺胃炎影响的肉鸡(Noiva et al., 2015)Fig. 1 Broiler chickens affected with proventriculi

1.3.2 剖检病变对发生腺胃炎的病鸡进行剖检，可以发现明显的腺胃肿大（图1-2）(Adair et al., 1979)，有的病鸡还表现为腺胃的苍白（图2）(JS and HJ, 1991; Guy et al., 1997)。剖开腺胃后，可观察到腺胃乳头肿胀，腺胃黏膜表面有显著的白色坏死点，严重者还表现为腺胃乳头的糜烂、出血甚至消失（图2）(Noiva et al., 2015)。图2 腺胃炎鸡剖检病变(Noiva et al., 2015)Fig. 2 Proventriculitischicken necropsy lesions注：a：严重肿大的腺胃和弥漫性苍白的浆膜；b：切开腺胃的内部；c：中度肿大的腺胃和弥漫性苍白的浆膜；d：切开腺胃的内部。Note: a: Severely enlarged proventriculus with diffuse pale serosa; b: cut surface of the proventricular wall;c: moderately enlarged proventriculus with mottled pale serosa; d: cut surface of the proventricular wall.1.3.3 组织学病变组织病理学观察可发现，病鸡表现出严重的腺体水肿、黏膜上皮细胞坏死脱落，腺管间单核细胞和淋巴细胞浸润和炎症反应（图 3）(Marusak et al., 2012; Bayyari et al.,1995b; Hess, 2000)。图 3 腺胃炎鸡病理组织学变化(Marguerie et al., 2011; Kim et al., 2015)Fig. 3Histopathological changes were observed in chicken with proventriculitis注：显微镜下显示腺胃腺上皮坏死，脱落的细胞和严重的淋巴细胞浸润。H＆E。Note: Photomicrograph of a proventricular gland showing necrosis of the proventricular epithelium,sloughed cells, and severely lymphocytic infiltration

.3.3 组织学病变组织病理学观察可发现，病鸡表现出严重的腺体水肿、黏膜上皮细胞坏死脱落，间单核细胞和淋巴细胞浸润和炎症反应（图 3）(Marusak et al., 2012; Bayyari et995b; Hess, 2000)。
【参考文献】

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本文编号：2867948