猪流行性腹泻病毒N蛋白相互作用细胞蛋白的筛选
发布时间：2020-11-03 21:54
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是一种急性接触性肠道传染病,以引起哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水为主要特征,一周龄内哺乳仔猪感染该病后死亡率可达100%,给世界养猪业带来巨大的经济损失。目前尚未有有效的疫苗和药物。PED病原为猪流行性腹泻病毒(Porcie Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)。PEDV的N基因编码的N蛋白是一种多功能的病毒蛋白,但缺乏与其相互作用蛋白的研究报道。为进一步了解N蛋白的生物学功能,探究N蛋白在PEDV复制过程中发挥的作用,本研究对N蛋白的相互作用蛋白质组学进行研究,获得与N蛋白相互作用的细胞蛋白,为下一步筛选抑制PEDV感染的药物靶标提供理论依据。为获得N蛋白相互作用的细胞蛋白,首先以PEDV PEDV LJX01/2014毒株的cDNA为模板,扩增PEDV N目的片段,将目的片段与pEGFP-C1真核表达载体进行连接,成功构建pEGFP-N重组质粒。将重组质粒转染293T细胞后,利用Pull-down实验特异性沉淀pEGFP-N蛋白及其相互作用的细胞蛋白并进行质谱分析,质谱结果表明,125种细胞蛋白可能与N蛋白相互作用。为了对质谱分析结果进行验证,根据不同的与对照相比获得的不同的变化比值筛选4种细胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1,用Western blot、免疫共沉淀和共定位研究进行鉴定。Western blot结果表明在293T和Vero E6细胞中,用N蛋白作为诱饵进行pull-down实验,结果表明N蛋白与细胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1均有相互作用;同时在293T和Vero E6细胞中分别用抗DHX9、NCL、KAP1和TCEA1抗体进行免疫共沉淀,结果表明4种细胞蛋白均能与N相互作用。用共聚焦显微镜观察这4种细胞蛋白与N蛋白的共定位现象,结果表明在感染PEDV的Vero E6和pEGFP-N转染的293T细胞种,均发现NCL与pEGFP-N存在共定位,而与其他3各蛋白没有共定位。本研究成功获得PEDV N蛋白的相互作用蛋白质组学,为进一步研究PEDV的致病机制奠定基础。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：
图 1 PEDV 基因组和病毒结构图（汪世雄等，2012）Fig. 1 Structural Diagram of PEDV genome（Wang et al., 2012）性腹泻病毒病毒学分类地位尼多目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状nae ） 、 α- 冠 状 病 毒 属 （ Alphacoronavirus ） 成 员 。 α- 冠 状avirus）成员包括人冠状病毒 229E(Human coronavirus 229E)、猪orcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、长翼蝙蝠冠状bat coronavirus 1) 、小黄蝠冠状病毒 512(Scotophilus bat coronavir性腹泻病毒非结构蛋白 蛋白的功能因编码一个 25.3k Da 的 ORF3 非结构蛋白，是 PEDV 的一个辅助非结构蛋白对 PEDV 的致病性改变有辅助作用，对 PEDV 在宿主有具体影响，该蛋白可能与冠状病毒毒力有关（Wongthida et al
图 2 绿色荧光真核表达载体 pEGFP-C1 物体图谱Fig. 2 The physical map of pEGFP-C1（http://www.biofeng.com/zaiti/buru/pegfp-n1.htmL）养基购自于 Gibco 公司；RIPA 细胞裂解液购自于碧；Protein marker 均购于Thermo 公司；0.25％胰蛋白酶购自于 GemCell 公司；罗氏脂质体(X-temeGENE HP trans素（Kan）同氨苄青霉素（Amp）购自于碧云天(BeyotimeFirst Strand cDNA Synthesis Kit 购自 Thermo 公司；胰A 试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒购自康为公司；存管均购自上海康宁公司；HRP-DAB 底物显色试剂盒 BamH I 和 Xho I、Trans2K Plus DNAmarker 均购自 Ta、重铬酸钾、无水乙醇、冰乙酸、氯化钠等均为国产分
图 3 PCR 扩增 PEDV N 基因片段及 pEGEP-N 重组质粒鉴定图R amplification of PEDV N gene fragment and pEGEP-N recombinant plasmid identificA：M：DNAMarker； 1：PEDV N 基因片段；Marker；1：阴性对照；2：pEGEP-N 菌液 PCR 鉴定结果；3：pEGEP-N 菌液 PCRC：M：DNAMarker；1：pEGEP-N 质粒酶切结果；2：pEGEP-N 质粒酶切结果；A: M: DNAMarker; 1. PEDV N gene fragment;Marker; 1: negative control; 2: pEGEP-N bacterial solution PCR identification results; 3bacterial solution PCR identification results;: DNAMarker; 1: pEGEP-N plasmid digestion results; 2: pEGEP-N plasmid digestion re的分析STAR 软件分析测序结果，测序获得的 PEDV N 基因片段与 GDNA 序列的相似性为 100%，蛋白序列的相似性为 100%。EGFP-N 质粒转染 293T 细胞后的鉴定微镜检测 pEGEP-N 蛋白的表达 重组质粒在过生工测序后 DNASTAR 软件分析证明该重组质粒
【参考文献】
本文编号：2869154
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：
图 1 PEDV 基因组和病毒结构图（汪世雄等，2012）Fig. 1 Structural Diagram of PEDV genome（Wang et al., 2012）性腹泻病毒病毒学分类地位尼多目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状nae ） 、 α- 冠 状 病 毒 属 （ Alphacoronavirus ） 成 员 。 α- 冠 状avirus）成员包括人冠状病毒 229E(Human coronavirus 229E)、猪orcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、长翼蝙蝠冠状bat coronavirus 1) 、小黄蝠冠状病毒 512(Scotophilus bat coronavir性腹泻病毒非结构蛋白 蛋白的功能因编码一个 25.3k Da 的 ORF3 非结构蛋白，是 PEDV 的一个辅助非结构蛋白对 PEDV 的致病性改变有辅助作用，对 PEDV 在宿主有具体影响，该蛋白可能与冠状病毒毒力有关（Wongthida et al
图 2 绿色荧光真核表达载体 pEGFP-C1 物体图谱Fig. 2 The physical map of pEGFP-C1（http://www.biofeng.com/zaiti/buru/pegfp-n1.htmL）养基购自于 Gibco 公司；RIPA 细胞裂解液购自于碧；Protein marker 均购于Thermo 公司；0.25％胰蛋白酶购自于 GemCell 公司；罗氏脂质体(X-temeGENE HP trans素（Kan）同氨苄青霉素（Amp）购自于碧云天(BeyotimeFirst Strand cDNA Synthesis Kit 购自 Thermo 公司；胰A 试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒购自康为公司；存管均购自上海康宁公司；HRP-DAB 底物显色试剂盒 BamH I 和 Xho I、Trans2K Plus DNAmarker 均购自 Ta、重铬酸钾、无水乙醇、冰乙酸、氯化钠等均为国产分
图 3 PCR 扩增 PEDV N 基因片段及 pEGEP-N 重组质粒鉴定图R amplification of PEDV N gene fragment and pEGEP-N recombinant plasmid identificA：M：DNAMarker； 1：PEDV N 基因片段；Marker；1：阴性对照；2：pEGEP-N 菌液 PCR 鉴定结果；3：pEGEP-N 菌液 PCRC：M：DNAMarker；1：pEGEP-N 质粒酶切结果；2：pEGEP-N 质粒酶切结果；A: M: DNAMarker; 1. PEDV N gene fragment;Marker; 1: negative control; 2: pEGEP-N bacterial solution PCR identification results; 3bacterial solution PCR identification results;: DNAMarker; 1: pEGEP-N plasmid digestion results; 2: pEGEP-N plasmid digestion re的分析STAR 软件分析测序结果，测序获得的 PEDV N 基因片段与 GDNA 序列的相似性为 100%，蛋白序列的相似性为 100%。EGFP-N 质粒转染 293T 细胞后的鉴定微镜检测 pEGEP-N 蛋白的表达 重组质粒在过生工测序后 DNASTAR 软件分析证明该重组质粒
【参考文献】
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1 郑逢梅;霍金耀;赵军;常洪涛;王晓梦;陈陆;王川庆;;2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J];病毒学报;2013年02期
2 石达;吕茂杰;陈建飞;时红艳;张志榜;冯力;;猪流行性腹泻病毒蛋白对Vero E6核蛋白B23.1的影响[J];中国兽医杂志;2012年04期
3 孙东波;冯力;时洪艳;陈建飞;;猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J];动物医学进展;2006年10期
4 严晶;霍克克;;双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用[J];生物化学与生物物理进展;2006年06期
5 魏亦男,李元宗,常文保,慈云祥;荧光共振能量转移技术在生物分析中的应用[J];分析化学;1998年04期
本文编号：2869154
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