四川省部分地区副猪嗜血杆菌的血清型调查及间接ELISA方法的构建

发布时间：2020-11-03 22:41

　　 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)作为一种猪呼吸道的条件致病菌,能引起猪的肺炎、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、脑膜炎和关节炎以及胸腔积液、心包积液、腹腔积液和关节积液,严重阻碍猪的生长育肥,并可致死亡,是保育猪威胁最大的病原菌之一。本研究从四川省部分地区的猪场采集疑似Hps感染病料进行Hps的分离、鉴定与分型,同时表达、纯化了Hps的YfeA蛋白,构建用于检测Hps抗体的间接ELISA方法。1.四川省部分地区Hps血清型调查2014年至2016年间,在四川省部分地区的规模化猪场及养猪合作社共采集649份病料,分离到288株Hps野毒,总分离率为44.38%,各年度分离率无显著差异。四川东部和西部地区发病情况基本一致,3~8周龄的猪分离率显著高于哺乳仔猪和8周龄以上的猪,冬、春季节分离率显著高于夏、秋季节。结合多重PCR和琼扩试验,对四川省部分地区Hps的血清型分布做了研究,结果表明,7.29%的分离株无法分型。2014年~2016年,四川省部分地区以血清4型、5型最为流行,其次为血清7型,未能分离到血清3型、6型、10型和15型的菌株。2.Hps抗体检测间接ELISA构建通过构建重组质粒pET-28a-yfeA,经转化、诱导、超声破碎、纯化,得到大小为36 kDa、浓度为0.698 mg/mL的Hps YfeA蛋白。经方阵滴定实验,最终确定YfeA蛋白最佳包被浓度为0.25μg/孔,HRP-兔抗猪IgG最佳稀释度为1:4000,待检血清的最佳稀释度为1:40,封闭、稀释和显色条件也做了相应优化。经计算,试验的判定前提为:阳性对照-阴性对照0.6,判定标准为:(样品OD450nm-空白对照)/(阳性对照-空白对照)≥0.4,判为阳性,反之判为阴性。经比较,该方法优于全菌抗原间接ELISA,并具有良好的批内和批间重复性,与进口商品化试剂盒的阳性和阴性符合率分别为79.2%和75%。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

图 1 Hps 感染猪大体病变(A): 纤维素性心包炎; (B): 纤维素性肺炎Fig. 1 Gross lesions in Hps infected pigs(A): Fibrinous pericarditis (B): Fibrinous pleuritis分离株 mPCR & AGD 血清分型情况R（图 2）与 AGD（图 3）结合试验，267 株 Hps 分离株的血 Hps 无法分型，占总分离株的 7.29%。

图 1 Hps 感染猪大体病变(A): 纤维素性心包炎; (B): 纤维素性肺炎Fig. 1 Gross lesions in Hps infected pigs(A): Fibrinous pericarditis (B): Fibrinous pleuritis.2 Hps 分离株 mPCR & AGD 血清分型情况经 mPCR（图 2）与 AGD（图 3）结合试验，267 株 Hps 分离株的血清型得到认。21 株 Hps 无法分型，占总分离株的 7.29%。

着同源性极高的片段，因此多重 PCR 时血清 2 型和 11 型的菌株会出现两个条带。Fig. 2 mPCR of serotyping for Hps field isolates and standard strains(A)M: DL 2000 DNA Marker (Takara); C: blank control; S1, S2, S4, S5, S7, S8 and S9: referencestrains of serovars 1, 2, 4, 5, 7, 8 and 98; FS1, FS2, FS4, FS5, FS7, FS8 and FS9: field isolates AB14011,GA14051, YA14041, GA14032, LS14031, GA15013, NC14041 (There were no field isolates ofserovars 3, 6, 10 or 15 obtained in the investigation).(B)M: DL 2000 DNA Marker (Takara); S11, S12, S13, S14, S3, S6, S10 and S15: reference strains ofserovars 11, 12, 13, 14, 3, 6, 10 and 15; FS11, FS12, FS13 and FS14: field isolates CD14021, LS15044,NJ14021, MY14021; N1: non-typeable strain; N2: APP; N3: Ss.Note: According to Howell et al, funB (target gene for serovar 1) was also identified in serovars 2 and11. Thus, except for their specific bands, the serovar -1-band can be also detected in serovars 2 and 11 inmPCR.
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本文编号：2869205