稳定表达犬瘟热病毒SLAM受体细胞系的建立及犬瘟热病毒的分离与鉴定

发布时间：2020-11-05 01:42

【摘要】：犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种在食肉目动物中广泛传播的急性,高传染性疾病,具有较高的发病率和死亡率。CDV野毒株很难在无受体的细胞系上进行传代,严重制约CDV的深入研究。本研究旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,比较其对CDV野毒株的敏感性,并对分离到的CDV野毒株进行全基因组测序、构建系统进化树。本研究从以下几个方面开展:Ⅰ SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系建立本将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定(IFA)和western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。结果显示本试验成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系。Ⅱ CDV的分离及鉴定本研究探索了SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系对CDV的分离率,比较不同组织对同种细胞系的趋向性,对分离得到的CDV进行RT-PCR、IFA鉴定、电镜观察、动物回归实验。结果显示利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞系,亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。Ⅲ CDV全基因组序列测序及系统发生分析对分离得到的CDV-SC1706株进行全基因组测序和系统发生分析,结果表明其核苷酸全长15690 bp。SC1706分离株的N基因系统分析显示该毒株与分离自辽宁的LN(10)1的同源性最高,达到99.6%,都属于亚洲1型野毒株。SC1706株与大熊猫分离株SX2014和Louguantai 1的同源性也分别达到了98.4%和98.3%,显示它们之间有很近的亲缘关系。与经典的onderstepoort疫苗株和shuskiy疫苗株的同源性很低,分别是有93.5%和93.1%。与CDV 3疫苗株的同源性最低,只有93%。SC1706株有9个潜在的N-糖基化位点,这一特点是野毒株特有的。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

a：具有脂质蛋白囊膜（黑色圆圈）的 CDV 示意图b：CDV 基因组结构模式图。图 1.1 在脂蛋白下面是病毒基质蛋白(深粉红色)，插入病毒囊膜的分别是血凝素蛋白(H)(黄色)和融合蛋白(F)(绿色)；大蛋白（L）（紫色）、核衣壳蛋白（N）（蓝色）和磷蛋白（P）（深紫色）这三个蛋白一起形成核糖核酸蛋白复合物（RNP）。该示意图没有说明蛋白质的相对丰度和比例。参考自 Sato 等人[26]。Fig. 1.1 Schematic diagram of a (a) CDV with a lipoprotein envelope (black circle), containing anon-segmented negative-sense ssRNAgenome, consisting of six genes (b). Adapted from Sato etal[26].

这两种受体都存在一种类似免疫蛋白的一个结合面[78]。SLAM 作为免疫细胞受体[79]树突细胞和巨噬细胞表面[78, 80]。第二种细胞受 CDV 的上皮细胞受体[77, 82]，Nectin-4 参与细和内皮组织的连接[83]。Nectin-4 被认为是一种细胞释放后，在感染的后期发挥作用[82]。M（CD150）激活分子(Signaling lymphocyte activation mol胞膜上的有八个潜在糖基化位点的一种糖蛋麻疹病毒属病毒的主要受体[85]，影响 CDV 的性[86]。SLAM 是有选择的表达在免疫细胞，形病毒共同的受体[88]（结构如图 1.2）。

的残基之间相似性很高，表明了这组动，将猫科和犬科动物进行比较，发现了几科动物 SLAM 受体的电荷差异[94]。因此不太适应与另一个非犬的 SLAM 受体结 受体犬身上发现了一个新的上皮细胞受体 ne的 6-9 d，病毒通过上皮细胞受体 Nect内分泌系统的上皮细胞[82, 97]。当宿主免统，使宿主产生神经症状[98]。Nectin-4 ，其他未知的受体也可能参与其中[99]。异体，这两种变体对病毒侵入及病毒在细
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本文编号：2870927