miR-29b在不同发育时期牛黄体中的表达规律分析及其对细胞凋亡和孕酮分泌的影响

发布时间：2020-11-06 19:21

　　 黄体(CL)是卵巢排卵后迅速形成的一种特殊结构,通过分泌孕酮来维持妊娠。黄体发育与退化的分子机制一直是动物繁殖领域研究的热点,其中细胞凋亡和血管发生伴随黄体发育的整个过程,并且越来越多的证据表明miRNA在黄体功能发挥过程中扮演重要的角色。miR-29b是肿瘤发生过程中的有效调节因子,靶向调控细胞增殖,周期,衰老,分化,凋亡和转移等过程。目前,已经证明miR-29b在不同发育时期的牛黄体中差异表达,然而,miR-29b在黄体中具体的功能和分子调控机制尚不明确。为了探索miR-29b在牛黄体中的功能,本研究通过RT-qPCR分析了miR-29b在不同发育时期牛黄体中的表达量变化,结果显示miR-29b在黄体发育的各个时期都有表达,表达量从早期到退化期逐渐降低,并且在后期黄体和退化期黄体中的差异不显著。为了进一步深入研究mi R-29b在牛黄体中的功能,本研究使用TargetScan,RNA22软件对miR-29b的靶基因进行了预测,并通过双荧光素酶报告实验证明了催产素受体(OXTR)是miR-29b在牛黄体中的一个靶基因。随后,本研究利用Western blot和免疫组化方法检测OXTR在不同发育时期牛黄体的表达规律,结果表明OXTR不仅在黄体发育的四个时期均有表达,且在大、小黄体细胞的细胞膜和细胞质中非常明显。而从前期黄体到退化期黄体,其蛋白表达水平也呈逐渐上升趋势。由于miR-29b在黄体中具有明显的差异表达并可能对黄体功能具有潜在影响,本研究对黄体细胞进行了分离和体外培养,并检测了miR-29b对牛黄体细胞增殖及孕酮分泌的影响。首先利用miR-29b mimics/miR-29b inhibitor对黄体细胞中miR-29b分别进行过表达和抑制,通过RT-qPCR、Western blot、ELISA以及流式细胞术等方法来检测miR-29b对OXTR蛋白表达、细胞增殖及孕酮分泌的影响。结果显示,过表达miR-29b能够显著降低OXTR的表达,而抑制miR-29b几乎不会影响OXTR的表达。过表达miR-29b能够促进牛黄体细胞孕酮的分泌,而抑制miR-29b则不会影响孕酮的合成。同时,流式细胞检测结果表明过表达miR-29b可抑制牛黄体细胞的凋亡,而CCK8实验则证明了miR-29b的过表达能够促进牛黄体细胞的增殖。综上所述,在本研究中,本文分析了miR-29b在不同发育时期牛黄体中的表达,并预测和验证了OXTR是miR-29b在牛黄体中的一个靶基因。miR-29b能够降低OXTR蛋白的表达、影响孕酮分泌、抑制黄体细胞的凋亡并调节黄体的功能。本研究通过明确miR-29b及其靶基因在黄体中的表达规律及其对黄体细胞增殖与凋亡的影响,解析了miR-29b及其靶基因调控黄体功能的作用机制,为深入了解黄体在发情周期中的作用提供理论依据,并为提高动物繁殖力及黄体相关疾病的治疗提供新方向。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S823
【部分图文】：

第二篇 研究内容 第 1 章 miR-29b 及其靶基因 OXTR 在不同发育时期黄体中的表达规律分析miR-29b 在黄体中的表达趋势和 OXTR 恰好相反，这些实验结果表明 OXTR 可能是黄体中 miR-29b 的潜在靶基因之一。为了检测 OXTR 的沉默是否由 miR-29b-3p 和 OXTR 靶位点之间的特异性直接相互作用诱导，本文使用 TargetScan 程序预测了 OXTR-3'UTR 中miR-29b-3p 的靶位置（图 1D）。 然后，本文构建了 pmir-OXTR-3'UTR 和 pmir-突变体-OXTR-3'UTR 载体，并将 pmir-OXTR-3'UTR 共转染到具有 miR-29b-3p模拟物的 HEK293T 细胞中，结果萤光素酶活性降低 30％；然而，miR-29b-3p模拟物和 pmir-mutant-OXTR-3'UTR 载体的共转染后，本文没有发现萤光素酶的活性发生显着变化（图 1E）。这表明 miR-29b-3p 可以调节 OXTR 的表达，OXTR是 miR-29b 在牛黄体中的靶基因。

图 1.2 OXTR 在不同发育阶段黄体中的定位。图（A），（B），（C）和（D）是不同发育时期牛黄体的 HE 染色结果。红色箭头表示大黄体细胞，蓝色箭头表示小黄体细胞。原始放大倍数 200 果。图（E），（F），（G），（H）和（I）是不同发育阶段牛黄体的免疫组织化学分析结果。比例尺，50um。Figure 1.2 Localization of OXTR at different CL developmental stages.(A), (B), (C) and (D) HE staining at different periods of bovine CL development. Redarrows indicate large CL cells, and blue arrows indicate small CL cells. Original magnification200×. (E), (F) (G), (H) and (I) Immunohistochemical analysis of OXTR localization duringdifferent stages of bovine CL development. Scale bar, 50 μm.3 讨论3.1 黄体是卵巢内动态变化的内分泌器官。黄体由卵巢卵泡排卵后发育而成并诱导子宫内膜细胞分化；在没有受精的情况下，黄体发生降解，黄体的形成和降解能够调控机体激素水平[109]。因此，黄体细胞的正常生理过程在机体的

2 实验结果2.1 miR-29b 能够调控牛黄体细胞中的 OXTR 蛋白水平为了进一步研究 miR-29b 对牛黄体细胞中 OXTR 的调控作用，本文用miR-29b mimics、miR-29b inhibitor 以及 NC 组转染黄体细胞。使用 RT-qPCR测量转染效率。miR-29b mimics 的转染能够显著增加 miR-29 的表达水平，并且用 miR-29b inhibitor 转染后能够显著降低 miR-29b 的表达水平，这表明转染实验是成功的，差异具有统计学意义（p＜0.01）（图 1A）。 同时，本文分析了OXTR 的表达水平，发现用 miR-29b 转染能够降低了 OXTR 表达，但用 inhibitor转染则对 OXTR 蛋白的表达影响不大（图 1B，C 和 D）。 基于双荧光素酶报告分析及转染实验这些结果，本文认为 miR-29b 可以降低牛黄体细胞中 OXTR 的表达，表明 OXTR 是 miR-29b 靶基因。
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本文编号：2873560