CK1抑制剂对牛卵母细胞体外成熟的影响

发布时间：2020-11-08 18:01

　　 哺乳动物卵母细胞的体外成熟是核移植、转基因动物等胚胎工程技术的基础和关键技术环节之一。虽然卵母细胞的体外成熟技术研究已经取得了长足进展,但由于卵母细胞体内外生长发育的生理环境不同,导致卵母细胞的体外成熟效率远低于体内成熟。CK1是细胞有丝分裂和Wnt/β-catenin信号通路中的关键激酶,影响细胞的增殖分化。本研究探讨了 CK1的抑制剂D4476对牛卵母细胞体外成熟效率的影响及其作用机制,以便为完善牛卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据。首先,探讨了 D4476对牛COCs的卵丘细胞扩展、体外成熟及其随后胚胎发育潜能的影响。黄牛COCs经含不同浓度D4476(0、2、5、10、20μmol/L)的成熟培养液培养 24h后,2μmol/L 和 5μmol/L D4476处理组的卵丘细胞扩展平均分值与对照组差异不显著(2.57、2.67vs2.68,P0.05),而 10μmol/L、20μmol/LD4476 处理组的卵丘细胞扩展平均分值显著低于对照组(1.92、1.26 vs2.68,P0.05);5 μmol/L和10 μmol/LD4476处理组的卵母细胞成熟率显著高于对照组(70.15%、73.94%vs 53.65%,P0.05),2μmol/L 和 20μmol/L D4476处理组的卵母细胞成熟率与对照组差异不显著(62.77%、67.85%vs 53.65%,P0.05)。各成熟培养处理组的卵母细胞经体外受精后发现,2 μmol/L和5 μmol/L D4476处理组的卵母细胞体外受精分裂率与对照组差异不显著(70.90%、73.52%vs 69.43%,P0.05),10 μmol/L和20 μmol/L D4476处理组的分裂率显著低于对照组(59.17%、48.57%vs69.43%,P0.05);2μmol/L、5μmol/L和 10μmol/LD4476处理组的囊胚发育率显著高于对照组(20.05%、28.00%、19.72%vs 15.67%,P0.05),20μmol/LD4476处理组的囊胚发育率与对照组差异不显著(14.71%vs 15.67%,P0.05)。其次,探讨了 D4476影响牛卵母细胞体外成熟效率的作用机制。实时荧光定量PCR和PI染色检测分析发现,5 μmol/LD4476处理组的卵母细胞CK1表达量显著下降(P0.05),但对卵母细胞核形态没有影响;Wnt信号相关基因β-catenin和Cx43表达无显著变化(P0.05),TCF-4的表达显著提高(P0.05)。5 μmol/LD4476处理组的卵丘细胞凋亡基因Bad表达无显著变化(P0.05),Wnt信号相关基因β-catenin、Cx43和TCF-4,增殖基因CTSB和MAPK,扩展基因PTGS-2、PTX-3和TGS-6,凋亡基因Bax以及抗凋亡基因Bcl-2的表达显著升高(P0.05)。Western Blot检测结果显示,5μmol/LD4476处理组的卵丘细胞Cx43蛋白表达在体外成熟过程中下降,在成熟后升高。以上结果表明,成熟培养液中添加5 μmol/LD4476能够提高黄牛卵母细胞体外成熟效率及其随后的胚胎发育能力,这一作用可能是D4476抑制了参与卵母细胞自发减数分裂的CK1的表达,提高核内转录辅助因子TCF-4的表达;同时,模拟Wnt信号,促进卵丘细胞的增殖、扩展,延缓卵丘细胞的凋亡而实现。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S823
【部分图文】：

大学硕士学位论文?．ＣＫ１抑制剂对牛卵母细胞体夕卜成熟培养的够使结肠腺瘤样息肉病蛋白和轴蛋白特定位点磷酸化，然后ＧＳＫ－３Ｊ３、ＣＫＣ与Ａｘｉｎ蛋白不同区域结合形成Ａｘｉｎ／ＧＳＫ－３ｐ／ＣＫｌａ／ＡＰＣ复合体，然后的Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ与复合体结合。首先Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ被ＣＫ１识别并磷酸化Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎＳｅｒ４５［５５］，紧接着被ＧＳＫ－３Ｐ进一步磷酸化［５６］，然后被Ｐ－Ｔｒｃｐ识别而发生泛进入蛋白酶体降解，使细胞内Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ维持在一个较低的水平，从而抑因的转录。当Ｗｎｔ蛋白和膜上Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白结合后，能够使ＣＫ１的活性，无法隣酸化Ａｘｉｎ，从而使细胞内Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ大量积累，随后（３－ｃａｔｅｎｉｎ进内，进而激活靶基因的转录［５７］。细胞核内转录只要是指当细胞内Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ细胞核内，ＴＣＦ和转录抑制因子Ｃｒｏｕｃｈｏ等结合在ＷＲＥ序列上，下游录将被抑制；当细胞内Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ进入细胞核，Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、ＴＣＦ和多种辅因子结合，启动下游基因的转录??ａｗｍｏｆｆ?ＨＬＷ－．－６ｂ?Ｗｎ，ｏｎ??

图４?Ｄ４４７６对黄牛卵母细胞核形态的影响??Ａ：?Ｏｊａｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６?Ｂ：?５｜ｉｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?Ｄ４４７６?ｏｎ?ｎｕｃｌｅａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｉｎ?ｂｏｖｉｎｅ?ｏｏｃｙｔｅ??Ａ：?０｜ａｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６?Ｂ：?５｜ｉｍｏｌ／Ｌ?Ｄ４４７６??

图５?Ｄ４４７６对黄牛卵母细胞内ｙＳ－ｃ攸ｍｉ、ＴＣ／Ｗ、Ｃｘ？表达的影响??注：标注不同字母代表差异显著（Ｐ＜０．０５）??
【参考文献】

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本文编号：2875136