miR-218对山羊PBMCs中SLAM受体表达调控的研究
发布时间：2020-11-09 04:13
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。PPRV与其他麻疹病毒属成员均对淋巴细胞和上皮细胞具有较强嗜性。PPRV因其淋巴细胞嗜性导致机体在感染后表现出持久的免疫抑制。现已证实,信号淋巴细胞活化分子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM),也称作CD150,是麻疹病毒属MV、CDV、RPV、PPRV在淋巴细胞的受体,可以在活化的以及记忆性的T细胞、B细胞,单核细胞,NKT细胞以及成熟的DC细胞中表达。因此,关于SLAM受体表达调控机制研究对深入阐明PPRV对宿主动物,特别在山羊等易感动物的致病机制具有重要意义。近年来,越来越多的证据表明宿主细胞microRNA(miRNA)是宿主-病原体相互作用复杂网络中不可或缺的调节因子。本研究旨在探索PPRV体外感染山羊外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)后,细胞源miRNA调节SLAM受体的作用机制及其对PPRV复制的影响,获得的主要研究结果如下:1)通过深度测序检测PPRV N75-1疫苗株感染对山羊PBMCs中miRNA表达谱的影响发现:与对照组相比,PPRV感染PBMCs 24 h后能够诱导316种显著差异表达的miRNAs,其中包括103种已知miRNAs与213种未知的miRNAs。通过对差异表达miRNAs进行靶向基因预测及功能分析发现,它们主要对细胞TLR信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞内吞作用、病毒致癌作用以及JAK-STAT信号通路等有调控作用。2)PPRV感染山羊PBMCs引起细胞肿胀、聚集成团,随着感染时间延长,细胞病变程度渐进性增强。以不同MOI(0.1、1、10)PPRV感染PBMCs,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-218及SLAM的表达水平发现,miR-218和SLAM表达水平分别呈现病毒感染剂量依赖性的降低和升高。此外,miR-218表达随PPRV感染时间的延长呈现先降低后升高的变化趋势,SLAM mRNA及蛋白表达水平随病毒感染时间延长呈先升高后降低的变化趋势,表明PPRV感染山羊PBMCs中miR-218和SLAM表达水平始终呈负相关。为进一步研究miR-218对PPRV感染山羊PBMCs中SLAM受体表达水平的调控作用,通过转染不同剂量浓度的miR-218 mimic,miR-218 inhibitor及其相应的Control序列发现,miR-218对PPRV感染PBMCs中SLAM受体表达水平的负调控作用具有剂量依赖性。此外,双荧光素酶报告基因实验表明miR-218可直接靶向SLAM基因的3'UTR。通过Western blot及ELISA检测转染并接毒处理后山羊PBMCs中不同细胞因子的蛋白表达及分泌水平,发现mi R-218通过调节SLAM通路介导的Th1型免疫反应影响PPRV的复制水平。3)通过使用紫外灭活PPRV(UV-PPRV)感染山羊PBMCs,qRT-PCR、Western blot及流式检测发现PPRV的复制能力是影响miR-218介导SLAM表达水平调节的重要因素。综上所述,本研究通过PPRV N75-1疫苗株感染山羊PBMCs,证实了细胞源miR-218对PPRV感染山羊PBMCs中SLAM受体表达的转录后水平调控作用及其对病毒复制的影响。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：
) 5’接头连接：5’接头连接至产物的 5’端，由于接头优先连接于单链分子，而3’接头和 RT 引物的杂交链连接，极大减少了接头自连；) 一链 cDNA 合成：以 RT 引物进行逆转录延伸，合成一链 cDNA；) PCR 扩增：使用高敏聚合酶对 cDNA 进行扩增，富集同时连接有 3’接头和头的 cDNA，放大文库产量；) 文库片段选择：使用 PAGE 电泳分离 100-120 bp 范围 PCR 产物，有效去除二聚体等副产物；) 文库定量及 pooling 环化。数据处理序所得 49 nt 序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得用分析的目标序列，对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。目标序列分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息。将所有小 RN后，用剩下的未注释片段来进行：1）novel miRNA 预测；2）已知 miRNA预测。对于鉴定得到的 miRNA 进行靶基因预测和对靶基因的 GO 功能注释 pathway 注释（图 2-1）。
图 2-2 对照组和 PPRV-infected 样品的 sRNA 长度分布Fig.2-2 Length distribution of small RNA(18-30 nt) in control and PPRV-infectedNA 差异表达分析在 SangermiR Base 21.0 数据库中使用 BLASTN 将测序样品的 miRN羊成熟 miRNA 及其前体比对，我们确定了本次 miRNA 测序结果数量以及它们第一位点的碱基偏好性。在对照组和 PPRV-infecte胞文库中分别鉴定出了 622 种（包括 260 种已知 miRNA 和 362 种新（包括 186 种已知 miRNA 和 298 种新 miRNA）。以 P 值＜0.01 并且ange）∣＞1 作为筛选阈值，共鉴定出 316 种差异表达 miRNA（包括 和 213 种新 miRNA），与对照组相比，PPRV-infected 样品文库中 147 种，169 种 miRNA 表达下调（图 2-3）（附件 2）。
图 2-3 对照组及 PPRV-infected 山羊 PBMCs 中差异表达 miRNAig.2-3 Comparison of differentially-expressed miRNAs between the Mock controlPPRV-infected goat PBMCs 靶基因预测用两种独立的算法（miRanda 和 RNAhybrid）对 PPRV 感染后每种行靶基因预测。对对照组和 PPRV-infected 两个样品差异表达的 1013 种新 miRNA 共预测到 12,065 种靶基因。两组共表达的 316 种基于靶基因在病毒感染、抗病毒反应、细胞凋亡中的调控作用鉴定 2-1）。与对照组相比，在这 15 种差异表达 miRNA 中，PPRV-infeA （ chi-miR-323a-3p ， chi-miR-485-5p ， chi-miR-1291 ， chi-m-5p，chi-miR-182，chi-miR-155-3p，novel_mir85，novel_mir70）表iRNA（chi-miR-1, chi-miR-143-3p, chi-miR-30b-3p, novel_mir330, no此外，这些差异表达 miRNA 靶向的大多数基因对免疫逃逸功能具
【参考文献】
本文编号：2875868
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：
) 5’接头连接：5’接头连接至产物的 5’端，由于接头优先连接于单链分子，而3’接头和 RT 引物的杂交链连接，极大减少了接头自连；) 一链 cDNA 合成：以 RT 引物进行逆转录延伸，合成一链 cDNA；) PCR 扩增：使用高敏聚合酶对 cDNA 进行扩增，富集同时连接有 3’接头和头的 cDNA，放大文库产量；) 文库片段选择：使用 PAGE 电泳分离 100-120 bp 范围 PCR 产物，有效去除二聚体等副产物；) 文库定量及 pooling 环化。数据处理序所得 49 nt 序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得用分析的目标序列，对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。目标序列分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息。将所有小 RN后，用剩下的未注释片段来进行：1）novel miRNA 预测；2）已知 miRNA预测。对于鉴定得到的 miRNA 进行靶基因预测和对靶基因的 GO 功能注释 pathway 注释（图 2-1）。
图 2-2 对照组和 PPRV-infected 样品的 sRNA 长度分布Fig.2-2 Length distribution of small RNA(18-30 nt) in control and PPRV-infectedNA 差异表达分析在 SangermiR Base 21.0 数据库中使用 BLASTN 将测序样品的 miRN羊成熟 miRNA 及其前体比对，我们确定了本次 miRNA 测序结果数量以及它们第一位点的碱基偏好性。在对照组和 PPRV-infecte胞文库中分别鉴定出了 622 种（包括 260 种已知 miRNA 和 362 种新（包括 186 种已知 miRNA 和 298 种新 miRNA）。以 P 值＜0.01 并且ange）∣＞1 作为筛选阈值，共鉴定出 316 种差异表达 miRNA（包括 和 213 种新 miRNA），与对照组相比，PPRV-infected 样品文库中 147 种，169 种 miRNA 表达下调（图 2-3）（附件 2）。
图 2-3 对照组及 PPRV-infected 山羊 PBMCs 中差异表达 miRNAig.2-3 Comparison of differentially-expressed miRNAs between the Mock controlPPRV-infected goat PBMCs 靶基因预测用两种独立的算法（miRanda 和 RNAhybrid）对 PPRV 感染后每种行靶基因预测。对对照组和 PPRV-infected 两个样品差异表达的 1013 种新 miRNA 共预测到 12,065 种靶基因。两组共表达的 316 种基于靶基因在病毒感染、抗病毒反应、细胞凋亡中的调控作用鉴定 2-1）。与对照组相比，在这 15 种差异表达 miRNA 中，PPRV-infeA （ chi-miR-323a-3p ， chi-miR-485-5p ， chi-miR-1291 ， chi-m-5p，chi-miR-182，chi-miR-155-3p，novel_mir85，novel_mir70）表iRNA（chi-miR-1, chi-miR-143-3p, chi-miR-30b-3p, novel_mir330, no此外，这些差异表达 miRNA 靶向的大多数基因对免疫逃逸功能具
【参考文献】
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4 王志亮;包静月;吴晓东;刘雨田;李林;刘佩兰;赵永刚;刘春菊;肖肖;;我国首例小反刍兽疫诊断报告[J];中国动物检疫;2007年08期
本文编号：2875868
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