PEDV感染猪空肠组织的蛋白质组学分析及hnRNP A1影响PEDV复制的作用机制研究

发布时间：2020-11-09 05:28

　　 近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起的新型猪流行性腹泻在世界范围内暴发,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。然而,当前防控手段的匮乏无法应对PED带来的威胁。因此,研究PEDV的致病机理以及开发抗PEDV药物对PED的防控和治疗具有深远的意义。本研究基于iTRAQ技术,开展了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠组织的比较蛋白质组学分析,为揭示PEDV的致病机理和宿主的免疫应答提供参考。根据蛋白质组学的分析结果,研究了hnRNP A1和PEDV N蛋白的互作关系,为揭示PEDV的复制过程提供参考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并阐明了其抗病毒机理,为PEDV的治疗和相关药物的开发提供了参考。主要研究内容如下:1.PEDV强毒株及其致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学分析本研究使用iTRAQ定量蛋白质技术结合液相二级质谱技术(LC-MS/MS),研究了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学变化。在强毒株YN13株感染组和弱毒YN144感染组分别鉴定到269和301个差异表达蛋白。生物信息学分析发现,差异蛋白主要涉及应激反应,信号转导和免疫反应等过程。进一步分析发现,PEDV感染可以导致多种干扰素刺激基因的上调表达,表明PEDV感染会诱导宿主的先天性免疫过程。通过对比分析两感染组的蛋白,发现许多热激蛋白家族成员和一些转录翻译相关因子在两组中呈现不同的表达情况,提示这可能是造成两毒株致病性差异的因素。2.核不均一蛋白A1(hnRNP A1)参与PEDV的复制过程根据蛋白质组学结果,发现hnRNP A1在两病毒感染组表现为不同的表达情况,提示该蛋白的变化可能会造成病毒致病力的变化。首先研究了该蛋白在细胞中定位情况,通过共聚焦试验发现该蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位,表明两者之间存在互作关系。使用免疫共沉淀技术,进一步确认了两者之间的互作关系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位区主要位于核周,而核周是冠状病毒复制转录复合体存在的位置,提示hnRNP A1可能参与了该复合体的组成,进而参与了PEDV的复制过程。为了验证hnRNP A1是否参与了PEDV的复制过程,通过siRNA沉默hnRNP A1的表达,而后使用不同PEDV毒株感染。通过间接免疫荧光试验、荧光定量RT-PCR和Western blot试验发现hnRNP A1沉默后,PEDV的基因组、PEDV感染的细胞数量以及PEDV N蛋白的表达量都显著减少,说明hnRNP A1参与了PEDV的复制过程。结合蛋白质组学结果,推测hnRNP A1在YN144感染组的下调表达是造成两病毒毒力差异的原因之一。3.槲皮素抗PEDV研究通过间接免疫荧光和Western blot试验,发现槲皮素可以有效抑制PEDV的感染过程。首先研究了槲皮素对PEDV吸附和入侵过程的影响,发现其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero细胞,表明槲皮素抗PEDV的作用发生在病毒入侵宿主细胞之后。由于槲皮素是一种很好的HSPA1抑制剂,其可能通过抑制HSPA1发挥抗PEDV效果。为验证此设想,使用siRNA沉默HSPA1的表达,然后再感染PEDV,通过荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot试验发现PEDV的感染过程并未受到影响。表明槲皮素的抗病毒效果并不依赖其HSPA1抑制剂的活性。通过Docking分析,发现槲皮素可以结合于PEDV 3C样蛋白酶的活性位点,表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表达纯化了PEDV的3C样蛋白酶,通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)验证了两者可以发生互作。为验证槲皮素是否可以抑制PEDV 3C样蛋白酶的活性,建立了一种荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法,通过该方法发现纯化的蛋白具有很好的酶活性,在酶反应体系中加入槲皮素,发现PEDV3C样蛋白酶的活性受到显著抑制,而且抑制效果呈剂量依赖性。因此,认为槲皮素可以通过抑制PEDV 3C样蛋白酶的活性而发挥抗PEDV效果。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

iTRAQ技术流程

iTRAQ结构

图 1-5 槲皮素的化学结构图Fig. 1-5 Structure of quercetin皮素抗病毒机制感染过程包括吸附、入侵、复制和释放等过程。抑制病毒
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本文编号：2875958