猪圆环病毒2型灭活疫苗（YZ株）的研制及免疫效力评价

发布时间：2020-11-10 08:42

　　 猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是当前我国广泛流行的猪传染性疾病,是由猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV-2)引起的。其中断奶仔猪最易感,临床表现多以断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)为特点,给我国乃至世界各国的养猪业造成了巨大经济损失。PCV-2引起的猪圆环病毒病目前尚无有效的治疗措施,而且PCV-2对外界抵抗力强,猪场净化难度高。疫苗接种仍然当前防控该病的最有效的手段之一。由于性能稳定、安全性高,灭活疫苗是当前主要的疫苗研发类型,虽然商业化的灭活疫苗已在世界各地养殖场广泛的应用,但其综合免疫效果仍有待提高。本研究首先对PCV-2YZ分离株的繁殖滴度、特异性、毒力、免疫原性等生物学特性进行评价;随后确立了猪圆环病毒2型YZ株的最佳细胞培养条件;进一步建立了 PCV-2YZ株的种子批并完成了各项鉴定;最后筛选和优化疫苗剂型和免疫佐剂,为研制出安全高效的PCV-2灭活疫苗奠定了基础。1.猪圆环病毒2型YZ株生物学特性研究为研究PCV-2 F1代病毒的生物学特性,采用间接免疫荧光法(Indirect fluorescence assay,IFA)测定病毒繁殖滴度,中和试验测定病毒特异性,PCR方法和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)试验测定病毒感染的毒力,进一步通过免疫攻毒保护试验评价该毒株的免疫原性。结果显示:PCV-2YZ株F1代病毒效价为105.48TCID50/ml,并可与PCV-2阳性血清发生特异性反应,中和后感染细胞未见荧光:用F1代病毒对3～5周龄健康易感仔猪肌肉注射和滴鼻病毒液各2.0 ml/头,可使仔猪(5/5)全部发病,出现典型的PCV-2感染相关临床症状及病理变化;将PCV-2F1代毒株制备灭活疫苗,并对健康仔猪(3～5周龄)进行免疫,结果发现,在二免后2 w,该疫苗不仅能提高仔猪体液免疫水平,诱导高效特异性抗体产生,而且能够有效抵抗3株不同来源流行株的攻击,保护率可达100%。以上试验结果表明:PCV-2YZ株F1代各项生物学特性稳定,而且该侯选株对目前的流行毒株具有良好的保护效力,可以作为疫苗株开展进一步的应用。2.猪圆环病毒2型YZ株最佳培养条件优化试验通过对D-氨基葡萄糖浓度、接毒时细胞密度、接种方式、接毒剂量、收毒时间以及收毒方法等一系列条件进行优化,采用间接免疫荧光方法检测病毒滴度,筛选出最佳PCV-2增殖条件。结果显示:以2-4 mmol/LD-氨基葡萄糖加入维持液,待细胞长至单层后按培养液10%的量接毒,37℃培养72 h,细胞及细胞液一起反复冻融后收获,获得的病毒滴度高,能达到105.50 TCID50/ml以上。采用上述最优培养条件分别在扁瓶和转瓶上对PCV-2的培养进行验证,取PCV-2 YZ株F1代病毒连续传5代后分别测其毒价,病毒含量仍不低于105.50 TCID50/ml,证明最佳培养条件可用于工厂化生产。3.猪圆环病毒2型YZ株种子批的建立及鉴定研究为了建立PCV-2(PCV-2)YZ株种子批,将PCV-2 YZ株F1代种毒,在PK-15细胞上连传至30代后分别测定各代次病毒液的TCID50。经测定各代次病毒液效价均稳定在105.0 TCID50/ml以上,且无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染;PCV-2阳性血清均能与PCV-2 YZ株F1、F10、F25、F30代病毒液发生较好的特异性中和反应;各代病毒液经传代后其免疫原性没有发生改变,具有良好的稳定性,根据以上结果确定PCV-2YZ株种毒基础种子批代次为F21代～F25代;生产种子批代次为F26代～F28代,连续继代不超过3代。选择F5-F10代病毒液测定其毒力,以确立强毒标准,同时对各代次病毒液的纯净性、特异性进行检验。结果显示:F5-F8代病毒液具有较强的致病性,可导致4/5头以上攻毒仔猪发病,而F9、F10代病毒液致病性则相对减弱,因此强毒代次定为F5-F8代。4.不同佐剂及剂型的猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备及免疫效力评价选用不同免疫佐剂,同时配合不同剂型,制备PCV-2灭活疫苗(YZ株),随后免疫仔猪后评价各疫苗的免疫效力。制备的灭活疫苗包括:选用10号白油制备油包水(W/O)剂型疫苗;选用ISA206VG佐剂(MontanideTM),制备水包油包水(W/O/W)剂型疫苗;分别选用ISA 15A VG和ISA35 VG佐剂(MontanideTM),制备水包油剂型(O/W)剂型疫苗;选用IMS251CVG佐剂(MontanideTM),制备水(W)剂型疫苗。除白油组外,其余4组疫苗安全性较好。5组疫苗免疫效力试验表明,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗组首免后2 w和3wPCV-2IFA抗体水平显著高于白油(W/O)和IMS251CVG(W)疫苗组(P0.05);攻毒后猪血清中病毒PCR检测,ISA206VG(W/O/W)疫苗组14d均为阴性,其他免疫组21～28 d转为阴性;猪淋巴结免疫组化检测,ISA 206 VG(W/O/W)、ISA 15A VG(O/W)疫苗组均未出现PCV-2阳性,且该两组中仔猪均未出现连续2d以上的高热症状。以上结果表明,ISA206VG(W/O/W)PCV2灭活疫苗(YZ株)对仔猪具有较好的综合免疫保护效力,可进行后续的临床扩大试验。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

使遗传物质得到高效的利用，在ＰＣＶ－２的ＯＲＦｓ之间是表现为相互紧密的重叠排列［３５］。一??定程度上，ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８之间的保守性较高，相比之下，??其余的ＯＲＦｓ保守性却很低（如图１）?％。通过分析ＰＣＶ－２的ＯＲＦｓ发现，其主要的阅读??框分别是ＯＲＦ１和ＯＲＦ２，大小均＞６００?ｂｐ［３７］。此外，通过比较ＰＣＶ－１和ＰＣＶ－２的阅读框发??现，二者的ＯＲＦ１相对较保守（核酸同源性为８３％；氨基酸同源性为８６％），而阅读框ＯＲＦ２??

ＰＣＶ－２?ＹＺ株Ｆ１代病毒液可与ＰＣＶ－２阳性血清发生特异性中和反应，其中病毒中和试??验组和培养基空白对照组在荧光显微镜下均未见荧光，而未中和的病毒对照组则在荧光显??微镜下观察到绿色荧光信号，结果表明该病毒具有良好的特异性（表１－２，图１－１）。??■■??图１－１?ＰＣＶ－２?ＹＺ?Ｆ１代ＩＦＡ试验结果??（１）感染对照组（２）中和试验组??Ｆｉｇ?１－１?ＩＦＡ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＦＩ?ｖｉｒｕｓ?ｆｒｏｍ?ＰＣＶ－２?ＹＺ?ｓｔｒａｉｎ??（１）?Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ；?（２）?Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｔｅｓｔ?ｇｒｏｕｐ??表１－２?ＰＣＶ－２?ＹＺ株ＦＩ代病毒特异性检测结果??Ｔａｂｌｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦＩ?ｖｉｒｕｓ?ｏｆ?ＰＣＶ－２?ＹＺ?ｓｔｒａｉｎ??特异性（绿色荧光信号）??病毒?中和组?阳性组?阴性组??Ｆ１?＋??注：“＋”表示在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号表示在荧光显微镜下观察不到绿色荧光信号??２．３毒力测定??２．３．１?ＰＣＶ－２阴性猪的筛选??３？５ｗ健康仔猪血清ＰＣＲ检测为阴性（图１－２），ＩＦＡ抗体检测也为阴性（图卜３）。??

?３１??清晰看不到黄染颗粒物质（图１－６）。健康对照组未见上述病理变化。??聲』々？心??肾赃病变，肾乳失出ｉ?髂内汫巴结庚深、肿大?眄系巴结肿大、出血??ＳＭ攻毒后猪各器官病变情况?．１备??Ｆｉｇ?１－４．?Ｔｈｅ?ｌｅｓｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎｓ?ａｆｔｅｒ?ｃｈａｌｌｅｎｇｅ??—．１：４．?：??图１－５攻毒猪淋巴结病理切片（４００ｘ）??Ｆｉｇ?１－５．Ｔｈｅ?ｐａｔｈ
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

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本文编号：2877733