利用免疫层析和免疫渗透技术检测H5亚型禽流感病毒的研究

发布时间：2020-11-11 15:54

　　 H5亚型禽流感病毒大多数都是高致病性的病原,一旦发生感染可造成家禽的大规模死亡,使养殖户蒙受巨大的损失,同时H5亚型禽流感病毒也能感染人,甚至造成人员死亡。我国鸡群中存在的H5亚型禽流感病毒,按照HA基因的亲缘关系划分,主要是Clade2.3.2、Clade7.2和Clade2.3.4.4分支的病毒。禽流感病毒一直不断的发生基因变异,2015年零星发现Clade2.3.2分支出现新的小分支Clade2.3.2.1e,2016年在我国多个省份大范围监测到Clade2.3.2.1e分支,H5亚型不同分支之间抗原差异较大,并且随着时间的推移,差异性越来越大,原来以单抗为基础的检测方法逐渐出现更大的偏差和漏检现象,因此,需要不断的更新单抗来修订。为此,本研究用H5亚型高致病性禽流感Clade7.2、Clade2.3.4.4分支和Clade2.3.2.1e分支的疫苗株,纯化后作为免疫原,结合单抗制备技术制备和筛选覆盖面较广的H5亚型禽流感单抗,进一步建立了以单抗为基础的免疫胶体金试纸条和渗透卡检测方法。本研究利用将Clade7.2分支疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7),Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(H5N1)(Re-10)作为免疫原,混合免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫之后,无菌取其脾细胞,将其与骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下进行细胞融合,经过间接ELISA方法及HI方法筛选得到6株能稳定分泌抗血凝素蛋白HA的单抗杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能与当前流行的分支反应,具有较好的广谱性。选用两株反应性较好的单抗2A10和2C8,用20 nm大小的胶体金颗粒对2A10抗体进行标记,10000转离心纯化,得到金标抗体,以1:8倍稀释喷涂于试纸条加样孔附近的玻璃纤维上;2C8以1.5 mg/mL的浓度喷涂于检测线;羊抗鼠二抗以1 mg/m L的浓度喷涂于质控线,组装成胶体金试纸条。利用免疫层析技术(GICA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现该胶体金试纸条能检出我国流行的H5亚型禽流感病毒,广谱性较好,对其他亚型不反应,特异性较好,最小检出的病毒量为2~4。为了进一步提高它的敏感性,我们将2C8单抗和羊抗鼠二抗点到渗透卡中,制备斑点金免疫渗滤卡,利用斑点金免疫渗滤法(DIGFA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现其最小检出的病毒量为2~2,敏感性得到提高。总之,本研究通过杂交瘤技术筛选出6株1B10、2A10、2C8、H2B1、3E6和4G9抗HA单抗;以单抗为基础材料,初步建立H5亚型禽流感病毒胶体金试纸条检测方法和H5亚型禽流感病毒斑点金免疫渗滤卡检测方法,渗透卡比胶体金试纸条灵敏性有所提高。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

blotting 鉴定结果显示：1B10、H2B1，推测 1B10、H2B1、4G9、3E6 单Re-7、Re-8 和 Re-10 毒株的约 70 ku表位，条带 70 ku 对应的是 HA 蛋 2A10 和 2C8 单抗对应的表位在 H区域。 2A10 与 Re-7、Re-8 和 Re-10 Western bllotting of monoclonal antibody 2A10 and ReRe-7 Re-8 Re-10HAHARe-7 Re-8 Re-10A1

图 2.1 单抗 2A10 的特异性Fig. 2.1 Specific of monoclonal antibody 2A10tting 分析 的 Western blotting 鉴定结果显示：1B10、H2B1、4G9 和 3E6无明显条带，推测 1B10、H2B1、4G9、3E6 单抗所对应的表抗分别在 Re-7、Re-8 和 Re-10 毒株的约 70 ku 和 40 ku 处出可能为线性表位，条带 70 ku 对应的是 HA 蛋白，条带 40 k，进一步推测 2A10 和 2C8 单抗对应的表位在 HA1 蛋白上而的一段氨基酸区域。图 2.2 单抗 2A10 与 Re-7、Re-8 和 Re-10 Western blotting 鉴定. 2.2 Western blotting of monoclonal antibody 2A10 and Re-7, Re-8 and ReRe-7 Re-8 Re-10HAHA1

图 2.1 单抗 2A10 的特异性Fig. 2.1 Specific of monoclonal antibody 2 blotting 鉴定结果显示：1B10、H2B，推测 1B10、H2B1、4G9、3E6 Re-7、Re-8 和 Re-10 毒株的约 70性表位，条带 70 ku 对应的是 HA 测 2A10 和 2C8 单抗对应的表位在酸区域。Re-7 Re-8 Re-10HA
【参考文献】

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7 李克生;杜惠芬;连晓雯;徐海聂;薄清如;黄新民;才学鹏;;禽流感病毒H5亚型金标快速诊断技术方法的建立及试剂盒研制[J];农业生物技术学报;2010年02期

8 徐一鸣;金宁一;杨振国;鲁会军;田明尧;王浩然;李昌;李霄;金扩世;;胶体金方法检测H3和H7亚型禽流感病毒[J];中国兽医学报;2009年05期

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10 吴仁蔚;肖运才;胡思顺;李自力;石德时;许青荣;毕丁仁;;禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析[J];中国兽医学报;2007年01期

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9 艾嘉亮;通用型禽流感病毒胶体金免疫层析诊断方法的建立[D];东北农业大学;2008年

本文编号：2879407