山羊gDB124沉默慢病毒载体的构建和稳转系的建立

发布时间：2020-11-11 13:39

　　 依据课题组对山羊附睾头和睾丸组织进行高通量转录组测序后差异基因分析后发现,山羊β-防御素124(Goatbeta-defensin 124,gDB124)在太行山羊附睾头组织大量表达,且在附睾头上皮细胞游离缘的纤毛层和管腔液有强阳性信号,推测其可能与精子的成熟及获能等有关。但是,目前关于gDB124与精子成熟间的作用机制尚不清楚。因此,本试验将通过建立gDB124稳定沉默细胞系,为gDB124沉默山羊附睾头细胞与未成熟精子共孵育的功能研究及gDB124沉默后下游信号通路的研究奠定基础。本试验通过胰蛋白酶消化法对剪碎的太行山羊附睾头组织进行培养,建立太行山羊附睾头细胞系;构建三个沉默gDB124慢病毒载体,分别为LV10-gDBB12-51、LV10-gDBB12-104、LV10-gDB124-161:用LV10-NC慢病毒阴性对照载体对太行山羊附睾头细胞最佳MOI值进行筛选;将三个慢病毒载体以最佳MOI值分别转染太行山羊附睾头细胞,通过荧光观察和荧光定量检测gDB124的mRNA表达情况,筛选出效率高的慢病毒载体;通过终浓度为0,1,2.5,5,7.5,10μg/mL嘌呤霉素对太行山羊附睾头细胞进行处理,72h后依据活细胞数确认嘌呤霉素最低致死终浓度;用嘌呤霉素对已使用慢病毒沉默gDB124的阳性细胞进行筛选,并进行多次传代培养,冻存和复苏,建立稳定沉默gDB124细胞系。研究结果如下:(1)成功建立了太行山羊附睾头细胞系,培养的山羊附睾头细胞生长趋势整体呈“S”型,符合细胞生长规律,能够稳定传代,且生长状态良好;(2)构建的三个沉默gDB124慢病毒载体分别为:LV10-gDB124-51、LV10-gDB124-104、LV10-gDB124-161,测序验证shRNA序列无误,经过慢病毒包装后滴度分别为 1×108TU/mL、3×108TU/mL、1×108TU/mL;(3)LV10-NC慢病毒载体对太行山羊附睾头细胞感染的最适MOI值为1。通过QRT-PCR筛选出干扰效果最好为LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161两种载体等量共转染(P0.0005),沉默效率达到50%;(4)太行山羊附睾头细胞对嘌呤霉素处理后细胞耐受浓度为终浓度1 μg/mL;(5)LV10-gDB124-51和LV10-gDB124-161慢病毒侵染太行山羊附睾头细胞后,获得了能够稳定传代且表达荧光的阳性细胞。综上所述,本研究成功建立了太行山羊附睾头细胞系,构建了三个沉默gDB124的慢病毒载体,并且筛选出沉默效率最高的载体,成功建立了稳定沉默gDB124细胞系。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S827
【部分图文】：

２结果与分析??２．１山羊附睾头细胞原代培养结果??图２－１中Ａ图为组织块消化后，原代细胞形态，可以明显看出细胞密度较大，显然??细胞刚从组织块中消化分离出，体积较小，形态多呈圆形。原代培养Ｉｄ后（图Ｂ），显??微镜下观察仍然存在部分细胞团，没有完全消化，细胞己经处Ｔ贴壁生Ｌ＜：状态。阁Ｃ和??图Ｄ为原代培养８?ｄ后，明显看出细胞生长状态很好，融合度达到９０％以上，可以看出??还有部分细胞团。??■圓??注：Ａ：附睾头组织经酶消化后获得的细胞；原代培养２ｄ；?Ｃ、Ｄ：原代培养８ｄ；??图２－１山羊附睾头细胞原代培养生长情况（Ｉ０ＵＸ）??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?ｂｕｃｋ?ｐｒｅｎｉａｎ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ（Ｋ）ＯＸ）??２．２传代培养结果??附睾头细胞经过连续传代细胞＾Ｌ＜：状态仍ｋ好，阁２－２分别为说代细胞传个：第??１７??

Ｆｉｇ．?２－２?Ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ?ｏｆ?ｂｕｃｋ?ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ（?１００?Ｘ）??２．３山羊附睾头细胞复苏培养结果??山羊附睾头细胞经过冻存、复苏后，细胞生长状态仍良好，图２－３Ａ图为细胞复苏??后刚铺到培养瓶中的状态，可以看出细胞都是圆形，还未贴壁生长，并没有大量细胞破??１８??

２．４山羊附睾头细胞生长曲线??根据埒次记录的细胞数３：，以培养天数为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制山羊附??睾头细胞生长曲线（图２－４）。细胞接种第Ｉｄ，细胞数量低于初始接种数量；从第２－３?ｄ??开始，细胞进入对数生长期；从第５?ｄ幵始，细胞生长速度减慢；从第６?ｄ开始，细胞??进入平台期。结果表明，培养的山羊附睾头细胞牛长趋势整体呈“Ｓ”型，符合细胞生长??规律。??２０００００－Ｉ??＼—??＾?１５００００－??＃??８??＾?１０００００－??＾?／??ＵＪ?５００００－??〇?＾??０?２?４?６?８?１０??ＤＡＹ??图２－４山羊附睾头细胞生长曲线??Ｆｉｇ．?２－４?Ｉ＇ｈｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｎ?ｃ?ｏｆ?ｃａｐｕｔ?ｃｅｌｌｓ??２．５?ｇＤ万／２ＶｍＲＮＡ在太行山羊附睾头细胞中的定位??图２－５为以在太行山羊附睾头细胞中原位杂交的结果。在荧光倒置显微镜下，??１９??
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本文编号：2879250