东方次睾吸虫转录组学和蛋白质组学分析及免疫相关基因鉴定

发布时间：2020-11-11 12:26

　　 东方次睾吸虫(Metorchis orientalis)寄生于鸡、鸭等禽类、野生鸟类及犬、猫、人等哺乳动物的胆囊和胆管内,造成肝胆损伤及功能障碍,严重者可引起死亡。由于东方次睾吸虫与华支睾吸虫的囊蚴形态相似,流行区域和中间宿主相同,寄生部位和临床症状亦相似,容易被误判为华支睾吸虫病。因此,东方次睾吸虫很可能是一种被忽视的重要人兽共患病原。东方次睾吸虫主要分布于亚洲,在我国多省有报道,福建、安徽和黑龙江等省为主要流行区。近几年东方次睾吸虫病的感染率逐年增高,对畜牧业和社会公共安全造成了极大的威胁。目前对东方次睾吸虫的研究工作主要集中在形态学、生活史、试验动物感染、流行病学调查、治疗和分子分类等方面,国内外关于东方次睾吸虫转录组和蛋白质组以及免疫诊断的相关研究还未见报道,影响了对东方次睾吸虫致病机制的深入研究和防治工作。因此,本研究拟对东方次睾吸虫的成虫、囊蚴和虫卵三个发育阶段进行转录组和蛋白质组学分析,通过对三个发育阶段东方次睾吸虫在转录水平和蛋白水平上的差异分析,揭示东方次睾吸虫不同发育阶段的生物学特征和代谢特征。根据组学分析结果筛选出东方次睾吸虫的诊断候选基因进行重组表达和免疫原性鉴定,建立东方次睾吸虫病间接ELISA诊断方法。主要研究结果如下:1.通过对东方次睾吸虫成虫、囊蚴和虫卵三个发育时期的转录组学测序,拼接获得不同发育期东方次睾吸虫Unigenes共199,723个,平均长度1,012核苷酸,N50值为1,396。共有91,398个Unigenes与已知数据库匹配,其中包括Nr(76,247,38.17%)、Nt(34,046,17.04%)、KOG(23,640,11.83%)、KEGG(19,141,9.58%)、Swiss-Prot(35,633,17.84%)、GO(50,577,25.32%)和Pfam(50,449,25.25%)数据库。三个发育时期共鉴定到23,071个差异表达基因,在成虫和囊蚴之间共有13,823个,在成虫和虫卵之间共有10,343个,在虫卵和囊蚴之间共有18,348个。对差异表达基因进行GO分析,发现除了基础代谢过程外,成虫阶段差异表达基因主要富集在微管合成、蛋白代谢和生殖行为等过程;囊蚴阶段差异表达基因主要富集在幼虫发育、胚胎发育和核分裂等过程;虫卵阶段差异表达基因主要富集在大分子复合物组装、神经元发育和细胞骨架等过程。KEGG分析发现了与肝脏纤维化相关的TGF-β信号通路。利用qPCR方法对三个发育阶段的差异表达基因进行了验证,结果各基因的表达趋势均与转录组测序结果一致。2.通过对东方次睾吸虫成虫、囊蚴和虫卵的蛋白质组学研究,共鉴定到3,616个蛋白质,三个发育时期共鉴定到2,571个差异表达蛋白,成虫和囊蚴之间共有1,445个差异蛋白,成虫和虫卵之间共有1,728个差异蛋白,囊蚴和虫卵之间共有1,936个差异蛋白,对三个发育阶段的差异蛋白进行GO和KEGG分析,结果表明在成虫阶段差异蛋白显著富集在蛋白质折叠、肌肉收缩的调节和糖酵解等功能,主要参与内质网中的蛋白质处理、核糖体和间隙连接等信号通路。在虫卵阶段差异蛋白显著富集在微管运动活化、三磷酸腺苷酶活化和螺旋酶活化等功能,主要参与剪接体、RNA转运和DNA复制等信号通路。在囊蚴阶段差异蛋白显著富集在磷酸转移酶活化、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活化和乌头酸水合酶活化等功能,主要参与缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解和甘油酯代谢等信号通路。利用PRM对三个发育阶段中的差异表达蛋白进行验证,表明PRM结果与蛋白质组测序趋势一致。在对东方次睾吸虫转录组和蛋白质组分析的基础上,对两种组学分析中的差异表达基因和差异表达蛋白进行数量、表达量、功能分类和代谢通路的比较关联分析,结果显示两组学的差异基因和差异蛋白在转录和蛋白水平上具有较好的一致性。3.对东方次睾吸虫的排泄分泌蛋白进行质谱分析,共鉴定到392个排泄分泌蛋白,全部关联到转录组和蛋白质数据库。依据排泄分泌蛋白质谱结果结合两组学数据分析结果和前期相关研究文献,筛选出7个免疫相关候选基因,成功地构建了候选基因的原核表达载体,并通过western blot对免疫原性进行鉴定。以重组蛋白rMoENO1和r MoCTSF作为抗原,成功建立了东方次睾吸虫病间接ELISA诊断方法。重组蛋白rMoENO1与rMoCTSF的ELISA诊断方法的敏感性分别为1:1600和1:800,且与鸭球虫、鸭对体吸虫、日本棘隙吸虫、舟形嗜气管吸虫和卷棘口吸虫阳性血清无交叉反应。通过对临床样品检测,发现建立的重组蛋白rMoENO1与rMoCTSF的间接ELISA检测方法在阳性检出率上无显著差异(P0.05),均可用于东方次睾吸虫病的血清学诊断。本研究对东方次睾吸虫三个发育阶段进行转录组和蛋白质组学进行测序分析,并建立了东方次睾吸虫病的ELISA诊断方法,研究结果可深入了解东方次睾吸虫不同发育阶段的生命活动特征和调控机制,为东方次睾吸虫的致病机制及免疫防治研究提供了重要基础数据。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.735
【部分图文】：

东方次睾吸虫转录组学和蛋白质组学分析及免疫相关基因鉴定、猫、狗的的感染率分别为 4.2%（4/95），66.7%（4/6），麦穗鱼的感染率为 87.6%（244/279）。张鸿满等[13]报道广别为 1.7%（2/119）和 2.4%（1/42），鱼类感染率为 25.6%河水系，家鸭感染率 17.2%（103/600），麦穗鱼的囊蚴平均 0.6%（6/1000）。方彦炎等[15]报道福建省浦城县，猫、狗1），30.775%（4/13），44.4%（4/9），而麦穗鱼的感染率为 6述地区为东方次睾吸虫的自然疫源地，都具有以下特点：量多，包括鸡、鸭、犬、猫等；二是有江、河、鱼塘、池中有大量的纹沼螺；四是居民有吃生的或未煮熟鱼的习惯

第一章 文献综述具和笼舍用生石灰水消毒；四是定期检查粪便，进行预防性药物驱虫东方次睾吸虫病就是要摒弃不良的饮食习惯，不吃生的或者不熟的睾吸虫病的治疗，主要是使用广谱抗寄生虫药物进行驱虫，如吡喹酮氯酚等。但盲目驱虫会造成药物的过度使用，不仅造成浪费，而且刺株和在畜禽体内的药物残留等问题[17-20]。综上所述，东方次睾吸虫病主要是缺少针对该病的基础理论研究，缺乏有效的生前诊断方法和新对该病的研究应致力于在探索东方次睾吸虫生物学特征的基础上，寻法和制定新的防治措施。

图 2-1 文库构建原理Fig. 2-1 Principle of library building，需要对原始测序序列（raw reads）进据分析都是在高质量的 clean reads 基础ed 数值大于 20 的碱基数占总碱基数的碱基数的百分比）值及 GC 含量（碱基效率评估序列读长（reads）进行净化处理，除掉序列，得到 clean reads。通过 Trinity 软
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 张鸿满;江河;吴惠芳;谭春萍;徐冰;谭裕光;黄福明;张陆娟;;广西东方次睾吸虫疫源地调查[J];海峡预防医学杂志;2009年05期

2 陈诚;张鸿满;江河;谭春萍;徐冰;胡文庆;;东方次睾吸虫的实验动物易感性研究[J];应用预防医学;2008年02期

3 朱玉霞;孙恩涛;李朝品;秦志辉;;淮河水系东方次睾吸虫自然疫源地调查[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2006年01期

4 李朝品,王健;淮河水系东方次睾吸虫生态学初步研究[J];中国寄生虫病防治杂志;2003年02期

5 林金祥,程由注,李友松,许龙善,林陈鑫,陈宝建,修文琼,张榕燕1,朱凯,李立,潘林祥,姚良治,凌广华;人体自然感染东方次睾吸虫的发现及其疫源地的调查研究[J];中国人兽共患病杂志;2001年04期

6 林金祥,李友松,程由注,许龙善,林陈鑫,陈宝建,修文琼,李立,潘林祥,彭振强;东方次睾吸虫(Metorchis orientalis)人体实验感染报告[J];海峡预防医学杂志;2001年02期

7 韩先桂,王佩良;鸭的东方次睾吸虫病[J];四川畜牧兽医;2001年02期

8 王寿昆;次睾吸虫在家鸭宿主种群中的空间分布格局研究[J];寄生虫与医学昆虫学报;1997年03期

9 杨光友;;雅安市10种鱼体内寄生后睾科吸虫囊蚴的调查[J];四川畜牧兽医;1993年03期

10 王寿昆;;福州地区家鸭次睾吸虫流行病学的调查研究[J];福建农学院学报;1992年03期

本文编号：2879177