利用RNA-seq技术分析可变剪接对小鼠早期胚胎发育影响的初步研究

发布时间：2020-11-11 23:58

　　 在小鼠受精卵的植入前发育过程中,存在两个重要的阶段,即母源调控向合子调控的转变(MZT)和早期胚胎的第一次细胞系分化。MZT可触发母源mRNA的降解及合子基因组的转录,而早期胚胎的第一次细胞系分化则形成内细胞团(ICM)及滋养外胚层(TE)两个细胞谱系。相关研究表明,ICM与TE细胞无论是在形态特征、基因表达,还是生物学功能方面都存在一定程度的差异,但是调控受精卵分化为ICM和TE这一生物学过程还未见统一的定论。可变剪接是一种在真核生物中十分普遍的转录后基因表达调控方式,能够将同一基因转录产物剪接为不同的mRNA,因此明显增加了高等真核生物基因组的信息含量及蛋白多样性。近年来,高通量测序技术的发展促进了全基因组可变剪接的分析技术的成熟,使可变剪接的相关研究变得易于实现。在这里,我们通过生物信息分析探究了可变剪接在小鼠胚胎植入前发育过程中的重要作用。为了有效地对大量转录组数据进行分析,我们编写了一键化转录组数据分析系统,并通过该系统分析了小鼠卵母细胞、受精卵、ICM、TE细胞之间基因表达(包括mRNA及lncRNA)及可变剪接的差异。结果表明,在卵母细胞受精形成受精卵的过程中,同时存在可变剪接及基因表达的变化,并且受精卵中可变剪接的事件要多于卵母细胞。对于只在卵母细胞时期发生可变剪接的基因及发生可变剪接并在受精时出现表达变化的基因,其生物学功能可发生部分重叠;对于只在受精卵时期发生可变剪接的基因具有对应的生物学功能,而发生可变剪接并与卵母细胞相比存在表达变化的基因由于数目太少而没有对应的生物学功能,这暗示可变剪接与差异表达可能共同调控了卵母细胞及受精前的发育,而受精后可变剪接与差异表达的共同调控作用消失。另外,在受精卵分化形成ICM/TE过程中,基因表达及可变剪接(包括可变剪接模式与数量)的变化仍然同时存在,对受精卵/ICM、受精卵/TE特异的差异可变剪接事件对应的基因进行功能富集分析的结果进一步显示,这些基因可能通过对细胞周期的调控,在第一次分化过程中发挥重要作用;而ICM/TE、受精卵/ICM、受精卵/TE各组内基因表达量的变化暗示基因表达水平的变化可能导致了受精卵的命运分化,最终形成ICM及TE两种细胞。在受精卵分化形成ICM/TE过程中,Prc1、Lin37及Vrk1是可变剪接差异最显著的3个基因,我们针对这三个基因进行了表达敲降试验,以试图阐释发生可变剪接的基因是否会对小鼠胚胎发育产生影响。结果表明,当Vrk1,Lin37和Prc1的表达存在缺失时,小鼠胚胎的卵裂率和囊胚率显著降低,说明它们对小鼠早期胚胎发育来说是不可或缺的,当其被敲降时,相应的可变剪接调控随之消失,进一步说明基因特异的表达及可变剪接对小鼠植入前胚胎的发育是十分重要的。在卵母细胞时期可变剪接与差异表达协同调控卵母细胞及受精前的发育;受精后,可变剪接与差异表达的协调作用消失。可变剪接可能通过影响细胞的分裂及分化而影响小鼠胚胎的发育。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S814.1
【部分图文】：

图 1-1 小鼠胚胎植入前发育过程（引自(Jukam et al., 2017)）Fig. 1-1 Development process of mouse embryo before implantation (cited from(Jukam et al., 2017)).1 小鼠母源调控向合子调控的转变“不需要双亲就可以创造生命”是 1937 年 Ethel BrowneHarvey首次提出的一个，Harvey 通过离心的方式除去了海胆卵子中的细胞核成分，然后用盐水激活结果惊讶地发现无核卵子开始卵裂并最终发育为含 500 个细胞的无核胚胎(Ha6)。显然，该研究并没有对所提出的言论作出准确的解释，只是说明在早期发

图 1-2 高通量测序的工作流程（引自(Besser et al., 2018)）Fig. 1-2 Workflow of high-throughput sequencing（cited from(Besser et al., 2018)）2.1 高通量测序技术的应用Illumina 公司的 Hiseq 系列测序平台为现在最广泛的平台。可以进行 DNA 测A 测序与甲基化测序等。DNA 测序可以进行全基因组测序、有针对性的重新测IP 测序。RNA 测序可以进行 mRNA、small-RNA、NONcoding-RNA 测序。随技术的发展，下游分析软件也慢慢的丰富起来，一代一代的变革，提升分析降低了分析时间。最重要的是大部分软件是在 Linux 平台下运行的，受影响于 L开源，软件都选择了在 githup 上开源，方便众人下载并修改源代码一代代aclaren et al., 1972 , Goldfeder et al., 2017 , Lopez-Fernandez et al., 2019 , Rey e9)。.1.1 DNA 测序吞吐量的提高和成本的降低使得人类全基因组测序得以实现。自从第一次大类基因变异研究以来，规模越来越大的项目已经陆续启动，涉及到成千上万的测序(Genomes Project et al., 2010 , Genome, 2009)。这些项目正在颠覆我们

西北农林科技大学硕士学位论文的全基因组的鉴定与分析中，发现超过 63%的多外显子基因发生了可变组织，早期阶段发生可变剪接的基因要多于晚期发育，并表明可变剪接基因结构和转录活性相关(Shen et al., 2014)。对二穗短柄草的全基因组可比较了单子叶植物与双子叶植物之间可变剪接事件与植物防御相关基因件(MandadiandScholthof,2015)。对幼年和成年人类心脏组织可变剪接分心脏幼年与成年可变剪接类型与数量是不同的(Giudice et al., 2014)。2 可变剪接的类型变剪接共有 8 种类型，分别为外显子跳跃（SE）、内含子保留（RI）、可（A5SS）、可变的 3’端位点（A3SS）、相互排斥的外显子（MXE）、可变子（AFE）、可变的最后一个外显子（ALE）、串联 3’端未翻译区域（UTR） 2016)（图 1-3 为这八种可变剪接类型的模式图）。通常来说，可变剪接最本形式为：SE，RI，MXE，A3SS，A5SS。
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本文编号：2879937