胶乳增强免疫比浊法定量检测猪瘟病毒E2蛋白方法的建立和应用

发布时间：2020-11-12 20:06

　　 猪瘟(Classical swine fever,CSF)在全世界范围内流行,患病猪主要表现为全身有出血点或出血斑,脏器有梗死灶,由此造成的猪只病死率高达90%,严重危害养猪产业。目前控制猪瘟的措施仍是以疫苗接种为主,猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白作为CSFV的主要保护性抗原,是新型疫苗研发的研究热点。蛋白含量检测是猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗半成品质量控制的关键,然而常规的蛋白定量检测方法都是针对溶液中总蛋白的检测,无法针对目的蛋白进行准确定量。为了解决这一难题,本课题利用针对CSFV E2蛋白的不同抗原表位的单克隆抗体,建立了针对CSFV E2蛋白的胶乳增强免疫比浊法(Latex nanoparticle-enhanced turbidimetric immunoassay,LTIA)。该方法能够特异性检测样品中的目的蛋白,且简单、快速。本研究首先将实验室已筛选的3株CSFV E2蛋白单克隆抗体(15A9、14F12和12H12)的杂交瘤细胞株复苏,制备腹水,通过间接免疫荧光(IFA)测定其效价。利用G蛋白亲和层析法对腹水进行纯化,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和二喹啉甲酸(BCA)法分别鉴定其纯度和浓度。然后采用双抗体夹心ELISA法初步对CSFV E2蛋白单克隆抗体进行配对筛选,再使用胶乳增强免疫比浊法进行单克隆抗体配对复筛,从而确定最佳的单抗配对进行后续实验。为进一步提高检测方法的灵敏度和准确性,将建立好的胶乳增强免疫比浊法进行反应条件和体系的优化。根据上述获得的最优条件组装胶乳增强免疫比浊法定量检测猪瘟病毒E2蛋白试剂盒,并确定了该试剂盒的检测线性范围和标准曲线,验证了其最低检出限、准确度和精密度。最后收集CHO细胞系统表达的CSFV E2蛋白样品,分别用SDS-PAGE、BCA法和本实验所建立的LTIA方法检测,并进行方法学比较。研究结果表明,使用CSFV E2蛋白单克隆抗体12H12和15A9配对标记胶乳微球,粒径为150 nm的胶乳粒子以及10:1的单克隆抗体标记比例时,该方法标准曲线的线性更好。该方法的反应体系为150μL的样品稀释液(R1),5μL的CSFV E2蛋白标准品,50μL的已进行抗体标记的胶乳粒子溶液(R2)以及200 s的反应时间。此外,该试剂盒的检测范围为25μg/mL~0.5 mg/mL,回收率范围为91%~100%,批内变异系数小于15%,批间变异系数小于10%。该方法对未纯化CSFV E2蛋白样品的检测结果与BCA法和SDS-PAGE法的检测结果趋势一致,满足其对样本的检测要求。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【文章目录】：
摘要
Abstract
文献综述
    第一章 猪瘟病毒E2蛋白及蛋白浓度检测方法的研究进展
        1.1 猪瘟病毒病原学
            1.1.1 猪瘟病毒的形态和结构
            1.1.2 猪瘟病毒的基因组结构及功能
            1.1.3 病毒编码的结构蛋白及其功能
            1.1.4 猪瘟病毒的入侵机制
        1.2 猪瘟的流行病学特征
        1.3 猪瘟的临床症状及病理变化
        1.4 猪瘟的诊断方法
            1.4.1 流行病学调查
            1.4.2 临床诊断和尸体剖检
            1.4.3 实验室诊断
        1.5 猪瘟的防控
        1.6 重组猪瘟病毒E2蛋白的质量控制
        1.7 常用蛋白质定量检测方法
        1.8 胶乳增强免疫比浊法的研究进展
            1.8.1 胶乳增强免疫比浊法的概述
            1.8.2 胶乳增强免疫比浊法的分类
            1.8.3 胶乳增强免疫比浊法的原理
            1.8.4 胶乳微球的种类
            1.8.5 胶乳增强免疫比浊法的应用
        1.9 研究目的及意义
试验研究
    第二章 猪瘟病毒E2蛋白胶乳增强免疫比浊法的建立
        2.1 材料
            2.1.1 实验动物
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 主要试剂
            2.1.4 试剂配制
        2.2 方法
            2.2.1 CSFV E2 蛋白单克隆抗体制备
            2.2.2 双抗体夹心ELISA初步筛选单抗配对
            2.2.3 胶乳增强免疫比浊法的建立
            2.2.4 胶乳增强免疫比浊法单抗配对复筛
            2.2.5 微球粒径的优化
            2.2.6 抗体标记比例的优化
            2.2.7 样品稀释液（R1）的优化
            2.2.8 反应体系的优化
        2.3 结果
            2.3.1 CSFV E2 蛋白单抗腹水效价测定
            2.3.2 CSFV E2 蛋白单克隆抗体纯度鉴定
            2.3.3 CSFV E2 蛋白单克隆抗体浓度检测
            2.3.4 双抗体夹心ELISA初步筛选单抗配对
            2.3.5 胶乳增强免疫比浊法单抗配对复筛
            2.3.6 胶乳粒子粒径的优化
            2.3.7 抗体标记比例的优化
            2.3.8 样品稀释液（R1）的选择
            2.3.9 反应体系的确定
        2.4 小结
    第三章 猪瘟病毒E2蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒的性能评价及应用
        3.1 材料
            3.1.1 主要仪器
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 试剂配制
        3.2 方法
            3.2.1 试剂盒的检测线性范围
            3.2.2 试剂盒的检测限
            3.2.3 试剂盒的准确度
            3.2.4 试剂盒的精密度
            3.2.5 方法学比较
            3.2.6 样品检测
        3.3 结果
            3.3.1 试剂盒的检测线性范围
            3.3.2 试剂盒的检测限
            3.3.3 试剂盒的准确度
            3.3.4 试剂盒的精密度
            3.3.5 方法学比较
            3.3.6 样品检测
        3.4 小结
    讨论
    结论
参考文献
致谢
个人简历

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本文编号：2881186