输卵管特异性表达人防御素4基因转基因鸡的制备

发布时间：2020-11-12 21:08

　　 抗菌肽是一类具有生物活性的小分子多肽,具有广谱的抗菌活性且不易引起细菌的耐药性,因其独特的抑菌机制,未来可能成为一种新型的抗菌药物。防御素是人体中一类重要的抗菌肽,根据结构可将其分为α和p防御素。人的防御素4(HNP4)是一种由DEFA4基因编码的α类型的防御素,成熟的HNP4由33个氨基酸残基组成,分子量约为3.7 kD。HNP4具有高效的抑菌活性,其抗大肠杆菌的活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的100倍左右,对链球菌和白色念珠菌的抗菌活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的4倍左右,另外HNP4还可以抵抗HIV及HSV等病毒的感染。利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的技术。鸡的输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。但是鸡的生殖系统较特殊,鸡胚的发育在蛋壳内进行,这些特点使得制备转基因鸡较困难。目前利用慢病毒和PGCs制备转基因鸡被认为是最可行的两种方法,但因外源基因的生殖传递效率较低,使得制备转基因鸡的技术仅在少数的发达国家有成功报道。本课题结合输卵管生物反应器的优势,利用慢病毒制备在输卵管中特异表达HNP4的转基因鸡。首先克隆了包含激素依赖性调控元件(SDRE)和负调控元件(NRE)的2.8 kb卵清蛋白启动子(Ova),并在细胞水平上验证了该启动子的生物活性。同时,通过化学合成的方法获得了5’端带有鸡溶菌酶信号肽序列并经过鸡密码子优化的HNP4序列,进而构建了利用ova启动子驱动HNP4基因表达的载体(pWPXL-Ova-HNP4和pWPXL-Ova-HNP4-His),并将其包装成相应的慢病毒。将慢病毒载体注射到自来航鸡胚的胚盘(X期)下腔中以制备转基因鸡,共注射了669个鸡胚,孵化得到了218只小鸡,孵化率为32.6%。将10只G0代生殖嵌合的公鸡与非转基因母鸡交配,在1274只后代中,鉴定得到了15只G1代转基因阳性鸡,生殖传递效率为0.6%～3.4%。Southern blot和Genome Walking结果显示G1代转基因鸡具有6个不同的插入位点,即单拷贝的HNP4分别插入到了鸡的1,2,3,4,6以及24号染色体中。对G1和G2代转基因鸡进行RT-PCR和免疫荧光分析,结果表明HNP4在G1和G2代鸡的输卵管组织中特异表达,而且ELISA检测的结果表明HNP4在G1和G2代转基因杂合体鸡蛋清中的表达量为1.65 μg/mL～10.18 μg/mL,不同插入位点的HNP4基因在转录和翻译水平存在显著差异。综上所述,本论文成功制备了能够在蛋清中表达HNP4的转基因鸡,且外源基因HNP4能够在G1和G2代转基因鸡中稳定表达,这一研究成果为利用输卵管反应器生产药物蛋白奠定良好的基础。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q51
【部分图文】：

然后进入细菌内部，在细菌内部进一步积累（Ｐａ化ｅｔａｌ．，２０００）。关于抗菌肤是如何??吸附到细菌膜上，一种解释是由于抗菌狀自身带有正电荷，沒些带有正电荷的抗菌化能够通过??电荷的作用与细菌膜上的负电位相互作用。在研究众多抗菌狀对膜的作用机制时，抗菌化对细??菌胞膜具体破坏方式又可Ｗ细分为４种方式，分别是聚集型模式（ａｇｇｒｅｇａｔｅ?ｃｈａｎｎｅｌ?ｍｏｄｅｌ），木??桶型模式（ｂａｒｒｅｌ－ｓｔａｖｅ?ｍｏｄｅｌ），地毯型模式（ｃａｒｐｅｔ－ｌｉｋｅ?ｍｏｄｅｌ）?Ｗ及环孔模式（ｔｏｒｏｉｄａｌ?ｍｏｄｅｌ）。??聚集型模式??聚集型模式主要是抗菌肢与细菌膜作用时，先与细菌的包膜形成相应的复合物，随着聚集??的抗菌肤的増多，巧菌化与膜形成的复合物也会变得越来越大，当细胞膜受到的张为达到一定??极限时就会遭到破坏．而破坏后抗菌化就可Ｗ直接进入细菌内部．最终导致细菌的死亡（Ｗｕ?ｅｔ??ａｌ．，１９９９）。??木桶模式??木桶模式描述的是抗菌化的疏水性表面与膜的脂质核屯、（ｔｈｅ?ｌｉｐｉｄ?ｃｏｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｅｍｂｒａｎｅ）进??行相互作用，形成跨膜通道。运个跨膜通道的形成包含Ｗ下几个过程．首先是抗菌化的单体??（ｐｅｐｔｉｄｅ?ｍｏｎｏｍｅｒｓ）?Ｗ螺旋状的形式进入细菌膜的疏水核屯、部位，随着抗菌化的数量增加，抗??菌化与细菌膜形成的孔径就越来越大．最终造成细菌膜内外的滲透压和酸碱平衡遭到破坏，导??致细菌死亡個?１－２）?（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔａｌ＂?２００４）。??

中巧农叱大学巧丄－学位论文?第一章文献综述??细胞膜疏水中必靠拔形成一个口径，从而使碟脂分子层向两侧弯曲形成一个环孔。像蜂毒素，爪??檐素从及ＬＬ３７这些抗菌肋都是从泣种机制进行杀菌的（Ｊｅｎｓｓｅｎ?ｅｔ?ａｌ．，２００６）。??地毯式模式??在这种模式中，抗菌肋首先大量的平铺到细菌胞膜的周围，但并不直接伸入到膜的内部，??而是抗菌肋单体优先结合到磯脂头部的基团，抗菌狀的亲水性表面会朝向隣脂的头部基团，导??致亲水性残基的方向得＾以改变（图１－３），最终将细菌的包膜破坏导致细菌死亡（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔ?ａｌ．，??２００４）。??

且在感染和发炎的状态中Ｐ防御素表达都会明显上升。??还发现ＨＢＤ－１．?ＨＢＤ－２，?ＨＢＤ－３还可通过直接结合到趋化因子ＣＣＲ６受体上来诱导Ｔ??成熟树突细胞趋化作用（Ｙａｎｇ?ｅｔａｌ．，１９９９）。另外在肥大细胞中，ＨＢＤ－２还可Ｗ通过百??和磯脂酶－Ｃ信号通路诱导肥大细胞的降解和迁移（Ｎｉｙｏｎｓ化ａ?ｅｔ?ａ］．，２００２）。??素是人类先天性免疫系统的一部分，在防止病原微生物进入机体时候发挥着重要的作??ａ防御素ＨＮＰ１，ＨＮＰ２和ＨＮＰ３能够抑制腺病毒巧郭头腺瘤病毒（ＨＰＶ）。除此之外，Ｐ??能够通过多种途径来抑制病毒的传染，如破坏病毒的包膜Ｗ抑制病毒进入细胞内和干??入细胞后进行的病毒复制通路等（Ｋｌｏｔｍａｎ?ａｎｄ?Ｃｈａｎｇ，?２００６）。体外实验证明ＨＢＤ－３能??毒的复制，ＨＢＤ－２能够有效的抑制大肠杆菌（Ｊｉａｎ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。一个有意思的现象是当??皮肤病的时候，防御素的浓度不会在体内增加，只有当皮肤感染或者发炎的时候，防??量才会增加（Ｒｉｓｓｏ．?２０００）。??素还具有抗病毒功能，为了应对病毒感染，铅细胞一般都会分泌一些细胞因子，趋化??其他抗病毒因子Ｗ控制病毒的感染，而一些细胞因子能够引起人的先天性免疫系统Ｗ??的感染。研巧表明ＨＩＶ－１能够促进ＨＢＤ－２和ＨＢＤ－３?ｍＲＮＡ的表达，但是不能够提高??的表达。但是病毒是如何刺激鞭细胞诱导产生相应的防御素，恩个机制目前尚不清楚??ｅｓ－Ｍａｔｅｕｅｔａｌ．，２０犯）。因为研究发现邸细胞缺少病毒进入细胞的受体，如ＣＤ４，?ＣＣ－趋化??（ＣＣＲ５）?Ｗ及ＣＸＣ趋化因子受体４（ＣＸＣＲ４），但是诱导的模式已经清楚（图１－１０）。??？?

本文编号：2881245