番鸭攻击行为关联基因的转录组学分析

发布时间：2020-11-14 04:14

　　 为从分子遗传学角度深入研究番鸭攻击行为的发生原因,进一步提高番鸭的福利水平,更好的服务于动物健康安全的生产,本试验应用The Medial Recorder2.0软件对选取的120只生长状况良好的番鸭进行为期1个月(每天24h)的行为观察记录,并采用瞬时观察法和连续观察法筛选出表现攻击行为的番鸭(试验组Ⅰ)、被攻击行为的番鸭(试验组Ⅱ)和未出现攻击行为且表现正常的番鸭(对照组);利用Observer XT行为学软件对选取的120只番鸭进行行为定义并分析各个行为之间的差异和联系。本试验采用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组三组番鸭(每组三次重复)的下丘脑组织中的差异表达基因进行筛选,利用GO和KEGG数据库对筛选的差异表基因进行功能注释,并进行差异表达基因聚类分析,结果显示:1.转圈行为分别与爪抓、打斗、啄羽、啄肛和饮水行为呈显著正相关(R=0.975,P0.05;R=0.973,P0.05;R=0.956,P0.05;R=0.968,P0.05;R=0.956,P0.05),与舒展行为呈显著负相关(R=-0.967,P0.05);爪抓行为与啄羽、啄肛和打斗行为呈极显著正相关(R=0.995,P0.01;R=0.998,P0.01;R=0.994,P0.01),与舒展行为呈显著负相关(R=-0.961,P0.05)。其他修饰行为与警戒行为呈极显著负相关(R=-0.991,P0.01);警戒行为与打斗、啄羽和啄肛行为呈显著负相关(R=-0.961,P0.05;R=-0.985,P0.05;R=-0.957,P0.05),与躲避和抬头行为呈显著正相关(R=0.953,P0.05;R=0.954,P0.05);躲避行为与打斗和啄羽行为呈极显著负相关(R=-0.991,P0.01;R=-0.997,P0.01),与啄肛行为呈显著负相关(R=-0.951,P0.05);打斗行为与啄羽行为呈显著正相关(R=0.956,P0.05);啄羽行为与啄肛行为呈极显著正相关(R=0.998,P0.01),与饮水行为呈显著正相关(R=0.955,P0.05);啄肛行为与饮水和抬头行为呈显著正相关(R=0.964,P0.05;R=0.965,P0.05)。饮水行为与采食行为呈极显著正相关(R=0.990,P0.01),与吞咽呈显著正相关(R=0.974,P0.05);采食行为与吞咽行为呈极显著正相关(R=0.992,P0.01);点头行为与低头和张嘴呈显著正相关(R=0.989,P0.05;R=0.951,P0.05)2.利用RNA-Seq技术筛选出攻击、被攻击和正常行为番鸭下丘脑组织中所有基因在行使生物学过程中所产生的SNPs、InDel位点和可变剪切事件,并发现它们在以上三组番鸭下丘脑组织的基因中,发生频率不同。该事件的发生可能导致番鸭内分泌失调以及出现啄羽、啄肛等异常行为。3.在攻击组番鸭的下丘脑组织中,筛选出差异表达基因626个,其中上调基因137个,下调基因489个;在被攻击组番鸭的下丘脑组织中,筛选出差异表达基因649个,其中上调基因232个,下调基因417个。GO数据库分析显示,攻击组差异表达基因主要涉及信号传导、蛋白结合、转运活动和神经调控等功能;被攻击组差异表达基因主要涉及信号传导、突触前活跃区域和跨膜受体蛋白激酶活性等功能。KEGG数据库分析显示:攻击组差异表达基因主要富集在代谢途径、FoxO信号通路、MAPK信号通路等7信号通路;被攻击组差异表达基因主要富集在核糖体、内吞作用、粘蛋白类型O-Glycan生物合成和ERBB信号通路等4个通路。3.通过对比攻击和被攻击两组中差异表达基因的GO和KEGG富集结果发现,在攻击组和被攻击组的所有差异表达基因中,共有2个GO terms被共同显著富集:行为和疼痛;在代谢途径中,ERBB信号通路被共同显著富集。对以上共同富集结果整合分析,筛选出75个番鸭攻击行为关键候选基因。4.利用RNA-Seq技术筛选出的与番鸭攻击行为相关的14个差异表达基因的表达量与荧光定量PCR技术测得的结果基本一致。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S834
【部分图文】：

图 3-1 cDNA 文库构建原理gure 3-1 The construction theory of cDNA lib量检测织 cDNA 文库构建之后，使用 Qubit2.0 对其浓度被稀释至 1ng/ul，然后使用 Agileninsert size）进行精确检测，确定 insert siz量基因扩增荧光检测系统）方法对文库的nM,以确保构建的 cDNA 文库的质量符合测iSeqTM2000 测序平台对待检测的番鸭下丘脑

因组定位分析，然后以 log2FC>1 或 log2FC<-1 且 FDR<0.05 为阈值进行差异表达基因的筛选，结合 GO 和 KEGG 数据库对筛选的差异表达基因进行后续的功能注释及富集分析(LiuYZ et al,2016)。2.6 测序结果的实时荧光定量 PCR 验证本实验应用实时荧光定量 PCR 技术对转录组筛选出的番鸭攻击行为关联候选基因中的 16 个基因进行验证（详见第四章）。实验结果显示：随机选取的 16个基因的相对表达量与转录组筛选出来的该基因的表达量基本一致，该试验结果表明转录组测序数据可信，可进行后续的测序试验分析。2.7 测序数据分析流程本实验通过利用 RNA-Seq 技术对攻击、被攻击和正常三组行为的番鸭下丘脑进行测序，将筛选出的所有基因序列与 NCBI 数据库已公布的绿头鸭的全基因组进行比对，并通过图 3-2 所示的流程对该数据进行生物信息分析。

图 3-3 测序错误率分布图Figure3-3Sequencing error rate distribution map3.1.2 A/T/C/G 碱基含量分布检测在 Illumina 测序平台的转录组测序中，所用的 6bp 的随机引物会使前几个位置的核苷酸组成存在一定的优势，但这种优势会影响测序结果的均一性。理论上在普通文库的构建中，碱基 C 和 G 及 A 和 T 的含量在每个测序循环中应分别相等且相对稳定，而对于特异性文库的构建则会出现 GC 分离的现象。在 Illumina测序的过程中，每个 read 的前 6-7 个碱基会出现较大波动，这属于正常现象。如图 3-4 所示，攻击、被攻击和对照三组的测序读长在 6 个碱基和 150 个碱基处，出现 GC 碱基分离情况，其余位置的读长均没有出现碱基分离情况，且 GC含量都在 46％左右，表明测序的均一性程度高，满足下一步测序要求
【参考文献】

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本文编号：2883060