木糖葡葡球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药机制的研究

发布时间：2020-11-14 05:07

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛的主要疾病之一,对全世界的奶牛养殖业以及乳制品行业造成巨大的经济损失。引起奶牛乳房炎的病原除了常见的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌等以外,凝固酶阴性葡萄球菌引起的感染呈上升趋势,已成为引起奶牛乳房炎发生病原的新特点。其中,木糖葡萄球菌在凝固酶阴性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎病例中的分离率呈逐年上升趋势,已成为主要的病原菌。奶牛感染后主要利用抗菌药物进行治疗,细菌长期处于药物选择压力下,逐渐进化为对该药物的耐药菌,甚至进化成为对其他种类药物的多重耐药菌,这给建立临床合理用药方案带来困难。因此,探究不同种类药物之间交叉耐药机制对于指导临床合理用药及抗菌药物减量使用意义重大。泰乐菌素作为大环内酯类药物中一种,被广泛应用于兽医临床中。其作用机制为阻止肽酰基tRNA从mRNA的“A”位移向“P”位,使氨酰基tRNA不能结合到“A”位,从而抑制细菌蛋白质合成。氟苯尼考作为酰胺醇类药物中的一种畜禽专用药物,也被广泛应用于兽医临床中,是一种典型的肽基转移酶抑制剂,阻止tRNA结合到A位,通过抑制肽键形成,竞争性地阻止转运状态,从而抑制肽基转移酶的活性。以往研究表明,细菌在单一药物选择压力下,会进化出对其他种类药物的耐药表型。但目前尚未见木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药机制的相关研究。故本研究拟通过蛋白质组学技术,初步确定可能与交叉耐药相关的蛋白;以体外诱导获得的泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌为研究对象,利用实时荧光定量PCR探究上述耐药相关蛋白在木糖葡萄球菌交叉耐药机制中的作用,阐明其在进化过程中的表达规律,确定与交叉耐药相关的耐药蛋白;利用分子克隆、基因测序、同源模建、分子对接以及基因组定点突变的方法,阐明木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药的分子机制。具体研究结果如下:(1)木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氯霉素类药物可能存在交叉耐药现象,推断与“转录相关蛋白”和“压力应激相关蛋白”有关。1/2 MIC(0.25μg/mL)泰乐菌素选择压力下,利用蛋白质组学i TRAQ技术,获得木糖葡萄球菌的差异表达蛋白。根据差异表达蛋白选择标准,即ratio1.2 or0.8(p-value0.05),筛选并鉴定出155个差异表达蛋白。其中氯霉素耐药蛋白上调1.69倍,提示泰乐菌素选择压力下,木糖葡萄球菌可能进化为对氯霉素类药物耐药菌。通过对差异表达蛋白进行生物信息学分析,结果表明差异表达蛋白主要聚类成与“转录相关”(核糖体蛋白L23(rplw)、转录调控因子IF-2(infB)和“压力应激相关”(过氧化氢酶(Kat)、硫氧还蛋白(trxA)、醛脱氢酶(aldA-1)、伴侣蛋白(gros)和L-乳酸脱氢酶(ldh))的两类蛋白。(2)泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌对氟苯尼考交叉耐药。以泰乐菌素为诱导药物,利用实验室体外强诱导方式,获得泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌,并考察其对氯霉素类药物氟苯尼考的耐药性,由0.5μg/mL升高至8μg/mL。(3)“转录相关蛋白”、“压力应激相关蛋白”以及氯霉素耐药蛋白可能在木糖葡萄球菌进化为对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药的过程中发挥重要的调节作用。基于不同水平的泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌,利用实时定量荧光PCR技术测定“转录相关蛋白”(核糖体蛋白L23(rplw)、转录调控因子IF-2(infB))、“压力应激相关蛋白”(过氧化氢酶(Kat)、硫氧还蛋白(trxA)、醛脱氢酶(aldA-1)、伴侣蛋白(gros)和L-乳酸脱氢酶(ldh))以及氯霉素耐药蛋白(cl)的表达水平,结果表明,随着耐药水平的升高,耐药蛋白均发生规律性变化,其中核糖体蛋白L23上调表达2.8倍、硫氧还蛋白上调表达4.2倍、醛脱氢酶上调表达2.4倍、伴侣蛋白上调表达5.93倍和氯霉素耐药蛋白上调1.5倍,L-乳酸脱氢酶下调2.5倍,而转录调控因子和过氧化氢酶表达并未发生差异性改变。(4)木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药可能与核糖体突变相关,包括核糖体蛋白L3 N135G、A137G、S142A和R162K、L4 S158N和A164E、L22 97KRTSAIN98氨基酸插入以及23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C。利用基因克隆、DNA测序以及DNAMAN序列比对分析,初步确定可能与交叉耐药相关的核糖体突变位点,利用PDB蛋白数据库中与木糖葡萄球菌核糖体蛋白L3、L4和L22一级序列同源性较高的金黄色葡萄球菌氨基酸序列作为模板进行同源模建,并对构建的蛋白进行优化和评估。在此基础上,利用CDOCKER方法,采用盲对接方式,将同源模建的核糖体蛋白与泰乐菌素和氟苯尼考分别进行分子对接,通过能量运算预测可能的结合位点。综合以上两部分结果确定可能与交叉耐药相关的核糖体突变位点为核糖体蛋白L3 N135G、A137G、S142A和R162K,L4 S158N和A164E、L22 97KRTSAIN98氨基酸插入以及23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C。(5)通过构建上述可能与交叉耐药相关的核糖体突变菌株,说明核糖体蛋白L2297KRTSAIN98氨基酸插入、23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突变是导致木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药机制之一。利用同源重组的方法,对木糖葡糖球菌基因组进行定点突变,同时引入绿荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)筛选标签,通过流式细胞仪筛选以及对突变片段DNA测序,最终获得6株基因突变菌株即木糖葡萄球菌rplC基因突变菌株、木糖葡萄球菌rplD基因突变菌株、木糖葡萄球菌rplV基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突变菌株和木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突变菌株。并对其耐药表型进行考察,结果表明木糖葡萄球菌rplV基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突变菌株和木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突变菌株对泰乐菌素的MIC由0.5μg/mL升高至128μg/mL,对氟苯尼考的MIC由0.5μg/mL升高至2μg/mL。(6)利用计算机分子模拟,构建木糖葡萄球菌rRNA结构,将其与泰乐菌素和氟苯尼考分别进行分子对接,结果表明23S rRNA A2275是两个药物的交叉结合位点。通过探究交叉结合位点与突变位点的空间结构关系,阐明上述试验结果的可信性,即核糖体蛋白L2297KRTSAIN98氨基酸插入、23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突变与交叉耐药分子机制有关。利用与木糖葡萄球菌同源性较高的金黄色葡萄球菌23S rRNA结构,通过DS 3.0中蛋白叠合模块,构建木糖葡萄球菌rRNA结构,包括23S rRNA和核糖体蛋白L3、L4和L22。进而利用SYBYL对接程序将构建rRNA与泰乐菌素和氟苯尼考分别进行分子对接,综合Crash和Polar打分情况确定泰乐菌素与23S rRNA结构中的核苷酸A2275、C2276、G2281、U2466和C2470形成了较强的氢键,氟苯尼考与23S rRNA结构中的核苷酸A2275和G2095形成氢键,它们共同的结合位点是A2275。(7)核糖体蛋白L22 97KRTSAIN98氨基酸插入和23S rRNA C1305A与T2560C核苷酸突变调节耐药蛋白表达是导致木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药机制之一。以木糖葡萄球菌rplV基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA A2662C基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突变菌株以及木糖葡萄球菌23S rRNA T2560C基因突变菌株为研究对象,考察耐药蛋白(核糖体蛋白L23、硫氧还蛋白、醛脱氢酶、伴侣蛋白和氯霉素耐药蛋白)转录表达水平,结果表明木糖葡萄球菌rplV基因突变菌株、木糖葡萄球菌23S rRNA C1305A基因突变菌株以及木糖23S rRNA T2560C基因突变菌株中耐药蛋白的转录水平发生差异性表达。然而,木糖23S rRNA A2662C基因突变菌株中耐药蛋白的转录水平未发生差异性表达。综上所述,木糖葡萄球菌对泰乐菌素和氟苯尼考交叉耐药受多个机制调控,不仅与核糖体蛋白L22 97KRTSAIN98氨基酸插入和23S rRNA A2662C、C1305A和T2560C突变有关,还与“转录相关蛋白”即核糖体蛋白L23、“压力应激相关蛋白”即硫氧还蛋白、醛脱氢酶、伴侣蛋白以及氯霉素耐药蛋白的差异表达有关。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.7
【图文】：

抗菌药物研发以及耐药性发生时间轴（轴上方为抗菌药物研发的时间为耐药性产生的时间）[34]re 1-1 The timeline of antibiotic deployment (above) and the antibiotic resiobserved (below)[34]耐药性已经成为全球关注的热点界卫生组织（WHO）针对耐药性问题发布一份报告即《抗微生物药物测报告》，其中表明抗微生物药物耐药性现象是普遍存在的，不分国籍此，细菌耐药性的问题已经是一个全球性问题。许多国家和国际组织的回应并采取积极的措施。2016年9月，联合国193个成员国签署了一作扫除“超级病菌”对人类健康的威胁[40]。许多发达国家如美国、日本续建立细菌耐药性监测系统，我国在2005年也展开行动[41]，包括兽用动物源细菌耐药监测网。同时也在2016年8月印发了遏制细菌耐药国20年）行动的通知。源性细菌耐药性已成为公共安全问题

技术路线

将其作为下一代诱导的母菌，重复以上步骤，见图2-1。对每一代诱导菌进行菌株的 PCR 鉴定和 MIC 测定，同时对其进行-80 保℃存。此外，为了考察上述获得耐药菌株的稳定性，利用无泰乐菌素的 TSB 培养基对耐药突变菌进行连续传10 代，依次取 0 代、2 代、4 代、6 代、8 代和 10 代的菌株进行 MIC 测定。20
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本文编号：2883116