水貂阿留申病抗体胶体金检测试纸条研制

发布时间：2020-11-14 13:56

　　 水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease of mink virus,ADV)引起的以浆细胞增多为主要特征的慢性、消耗性、病毒性传染病。主要侵害水貂的免疫系统,导致机体免疫系统紊乱,死亡率极高,严重损害了水貂养殖产业的健康发展,该病存在于绝大多数养殖水貂的国家和地区。目前,能有效预防该病的疫苗尚未研制成功,该病的防治已成为水貂养殖领域的世界性难题,在防治方面主要采取检疫淘汰阳性貂的办法。本研究采用原核表达系统与胶体金免疫层析技术,针对ADV抗体快速检测试纸条技术进行了初步研究。?应用生物软件分析截取实验室分离的ADV流行毒株ADV-DL125株基因VP2基因抗原表位区705 bp片段。设计特异性引物,对其进行PCR扩增。将PCR扩增产物与原核表达载体pET-28a(+)连接,获得原核表达载体pET-28a-VP2a。将其转入感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,可在大约28KD处获得特异性蛋白条带。经Co-NTA亲和层析法得到VP2a纯化蛋白,WesternBlot检测结果表明,pET-28a-VP2a蛋白能够与ADV阳性血清发生特异性反应。?利用柠檬酸三钠还原法制备不同直径大小的胶体金颗粒,确定直径30 nm的胶体金颗粒用于标记蛋白。根据胶体金免疫层析的原理,本实验用胶体金标记纯化后的VP2a蛋白作为金标垫,纯化后的VP2a蛋白作为NC膜上检测线(T)的划线抗原,纯化的ADV阳性血清IgG作为NC膜上质控线(C)的划线抗体。通过优化各反应条件,确定金标蛋白最佳标记浓度为10μg/mL,最佳标记pH为8.69,T线抗原浓度为0.7 mg/mL,C线抗体浓度为0.9 mg/mL。试纸条特异性、敏感性、重复性和稳定性检测结果表明,本研究所研制的试纸条能与水貂ADV阳性血清发生特异性反应,与水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎、圆环病毒阳性血清不反应,与对流免疫电泳的符合率可达92.9%。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.92
【部分图文】：

悬浮物转移到的底部有可开闭出将还留在管壁上的填料冲洗出并收集流出液。用 5 mL 清洗脱液洗脱组氨酸标签蛋白，重浓度。集到的所有流出液。S 进行 50 倍稀释，用超微量快8a-VP2a PCR 鉴定质粒 pET-28a-VP2a 为模板扩增大小约 705 bp 相符的目的条带

经琼脂糖凝胶电泳鉴定得到约 705 bp 目的基因片段和约 5369 bp 的载体片段，与预期结果相符，结果如图1-2。图 1-2 重组质粒 pET-28a-VP2a 的酶切鉴定M：DL15000DNA 相对分子质量标准；1：酶切产物Fig.1-2 Idention of pET-28a-VP2a recombinant plasmid by restriction stionenzyme digestionM: DNA marker DL 15000bp; 1: Products of enzyme dige1.3.3 表达 pET-28a-VP2a 蛋白的 SDS-PAGE 检测图 1-3 中 3～8 为诱导 2～7h 的结果，可以看出在重组表达载体在诱导 4 h时蛋白量表达量最多。图 1-4 中 2～7 为 IPTG 浓度分别为 0.2 mmol／L、0.4 mmol／L、0.6 mmol／L、0.8m mol／L、1.0 mmol／L、1.2 mmol／L 下诱导 5 h 蛋白表达量，可以看出 IPTG 终浓度为 0.8 mmol／L 时蛋白表达量最多，因此pET-28a-VP2a 蛋白诱导最佳条件为 0.8 mmol／L 的 IPTG 诱导 4 h 的蛋白表达量，其大小与预期结果约为 28 KD 相符。图 1-3 pET-28a-VP2a 在 BL21 中的表达M：低分子量蛋白标准；1：诱导前；2：空载体 pET-28a（+）；3～8：pET-28aVP2a 在 BL21（DE3）中诱导 2～7h 的表达结果Fig.1-3 Expression of pET-28a-VP2a in BL21（DE3）M: Low molecula

图 1-2 重组质粒 pET-28a-VP2a 的酶切鉴定M：DL15000DNA 相对分子质量标准；1：酶切产物 of pET-28a-VP2a recombinant plasmid by restriction stionM: DNA marker DL 15000bp; 1: Products of enzyme dige-28a-VP2a 蛋白的 SDS-PAGE 检测～8 为诱导 2～7h 的结果，可以看出在重组表达最多。图 1-4 中 2～7 为 IPTG 浓度分别为 0.2 mm／L、0.8m mol／L、1.0 mmol／L、1.2 mmol／L看出 IPTG 终浓度为 0.8 mmol／L 时蛋白表白诱导最佳条件为 0.8 mmol／L 的 IPTG 诱导 4果约为 28 KD 相符。
【参考文献】

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本文编号：2883549