猪德尔塔冠状病毒抗原及抗体检测方法的建立

发布时间：2020-11-17 11:37

　　 猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的肠道致病性冠状病毒。仔猪感染PDCoV后出现呕吐、腹泻和脱水等症状,有较高的发病率和死亡率,是导致仔猪死亡的重要原因之一。目前,在多个国家和地区都检测到了 PDCoV,在国内多个省份也有该病毒的相关报道。鉴于PDCoV在猪群中的广泛流行性及潜在威胁,本研究建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法和细胞免疫组化法,以及检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA方法。1.检测PDCoV抗体的间接ELISA方法的建立本研究通过DNAStar Protean软件对PDCoV N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265～342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。分别利用pET-32a和pGEX-6p-1表达系统进行原核表达,获得的两种融合蛋白分别带有His和GST标签,命名为PDCoV-N-His和PDCoV-N-GST,且均呈可溶性表达。Western Blot鉴定结果显示两个重组蛋白大小均与预期相符,分别约为31 kDa 和 36 kDa。利用Ni-NTA亲和层析介质和高亲和力GST纯化介质,分别纯化出两种重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测,经比较,以PDCoV-N-His作为包被抗原检测效果更好。最终以PDCoV-N-His作为包被抗原建立了检测PDCoV特异性抗体的间接ELISA方法。经测定,该方法具有良好的特异性且重复性良好,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)特异性阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。应用该方法对20份己知阳性血清和20份阴性血清分别进行检测,结果显示阳性符合率为100%(20/20),阴性符合率为100%(20/20),表明方法的特异性良好,可以进一步用于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。2.检测PDCoV抗体的细胞免疫组化法的建立根据完整PDCoV N基因序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆N基因,进而构建表达N蛋白的慢病毒载体。以包装的慢病毒感染Vero细胞,通过4μg/mL的嗓呤霉素筛选,获得稳定表达N蛋白的重组细胞系Vero/PDCoV-N。经Western Blot鉴定,该细胞系能表达与预期大小相符的41 kDa的蛋白条带。应用该细胞系进一步建立了检测PDCoV特异性抗体的细胞免疫组化检测方法。应用该方法检测已知PDCoV阳性血清,显色后细胞质呈现特异性棕褐色,而作为对照的Vero细胞无任何颜色反应。该方法的建立为PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查提供了另外一种有效的血清学检测方法。3.检测PDCoV抗原的双单抗夹心ELISA方法的建立本研究以PDCoV-N-His蛋白为免疫原,以PDCoV-N-GST蛋白为检测抗原,采用杂交瘤技术,经ELISA筛选获得了 6株能稳定分泌针对PDCoVN蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C5、5C5、8C12、8E8、10A7。亚类鉴定结果显示,在6株单抗中,4株为IgGi亚型,2株为IgM亚型。对6株单抗的相对亲和力和抗原结合表位进行综合分析,选择1A2为捕获抗体,HRP偶联的5C5为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。该方法的双对数回归拟合线线性相关系数大于0.99,通过回归方程确定定量分析PDCoVN蛋白的检测范围为80 ng/mL～1.3μg/mL。批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,表明方法具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的双单抗夹心ELISA方法展示出对重组N蛋白的良好检测效果,有望以此为基础进一步开发出可用于临床PDCoV感染诊断的特异性抗原检测方法。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

部分ＰＤＣｏＶ阳性样品感染ＰＥＤＶ［５Ｑ，５Ｉ］。为应对ＰＤＣｏＶ对美国猪群的影响，２０１４年６月５??日美国农业部颁布了一项法令，要求及时上报所有的猪腹泻病例［５１】。随后ＰＤＣｏＶ在加拿??大［５２】、泰国［５３］、韩国１５４］、日本［５５］、越南［５６］、中国［５７，５８］等地均有出现和报道（图１．３），呈现??全球流行的趋势。??戰??图１．３?ＰＤＣｏＶ世界分布图［５９】??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｓｗｉｎｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｆｏｒ?ｐｏｒｃｉｎｅ?ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ??自２０１２年在香港地区首次发现ＰＤＣｏＶ以来，中国其他地区不断出现了?ｒｏＣｏＶ的相??关报道。２０１２年下半年，中国西部四川地区检测到ＰＤＣｏＶ＿；?２０１５年，ＳＵ等［６１】对黑龙??江地区的３１９份猪腹泻病料进行检测，ＰＤＣｏＶ阳性率为１１．５９?（３７／３１９）；?２０１５年，对中国??南部部分省份地区的哺乳仔猪进行检测，整体发病率仅１．２８％，虽然检出率较低，但几乎??每个省份都有ＰＤＣｏＶ检出〖６义２０１６年，天津某猪场出现仔猪腹泻，赵峰等［５７］从该猪场发??病仔猪粪便中检测到ＰＤＣｏＶ，命名为ＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６，经全基因测序分析其核苷酸序列??与中国流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登录号：ＫＰ７５７８９２，?ＫＰ７５７８９１，?ＫＲ１３１６２１，ＫＴ２６６８２２?和?ＪＱ０６５０４３??等）和某些美国流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登录号：ＫＪ７６９２３１

部分ＰＤＣｏＶ阳性样品感染ＰＥＤＶ［５Ｑ，５Ｉ］。为应对ＰＤＣｏＶ对美国猪群的影响，２０１４年６月５??日美国农业部颁布了一项法令，要求及时上报所有的猪腹泻病例［５１】。随后ＰＤＣｏＶ在加拿??大［５２】、泰国［５３］、韩国１５４］、日本［５５］、越南［５６］、中国［５７，５８］等地均有出现和报道（图１．３），呈现??全球流行的趋势。??戰??图１．３?ＰＤＣｏＶ世界分布图［５９】??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｗｏｒｌｄ?ｗｉｔｈ?ｓｗｉｎｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｆｏｒ?ｐｏｒｃｉｎｅ?ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ??自２０１２年在香港地区首次发现ＰＤＣｏＶ以来，中国其他地区不断出现了?ｒｏＣｏＶ的相??关报道。２０１２年下半年，中国西部四川地区检测到ＰＤＣｏＶ＿；?２０１５年，ＳＵ等［６１】对黑龙??江地区的３１９份猪腹泻病料进行检测，ＰＤＣｏＶ阳性率为１１．５９?（３７／３１９）；?２０１５年，对中国??南部部分省份地区的哺乳仔猪进行检测，整体发病率仅１．２８％，虽然检出率较低，但几乎??每个省份都有ＰＤＣｏＶ检出〖６义２０１６年，天津某猪场出现仔猪腹泻，赵峰等［５７］从该猪场发??病仔猪粪便中检测到ＰＤＣｏＶ，命名为ＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６，经全基因测序分析其核苷酸序列??与中国流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登录号：ＫＰ７５７８９２，?ＫＰ７５７８９１，?ＫＲ１３１６２１，ＫＴ２６６８２２?和?ＪＱ０６５０４３??等）和某些美国流行株（ＧｅｎＢａｎｋ?登录号：ＫＪ７６９２３１

智能生化培养箱?常州恒隆仪器有限公司??电子天平?上海越平科学仪器有限公司??法??ＤＣｏＶＮ蛋白的原核表达???ＰＤＣｏＶＮ蛋白原核表达质粒的构建??过ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ软件，对本实验室测定的ＰＤＣｏＶＣＨＮ／Ｔｉａｎｊｉｎ／２０１６株列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＫＹ０６５１２０）进行分析，挑选其中抗原性较好的一），根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性规律，对其基因片段进行密码子优化隆，基因片段两端分别加上Ｉ和说〇?Ｉ限制性内切酶识别位点，优０＾／委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。利用限制性内切酶将人工合成的Ｎ基因片段定向克隆入原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ和ｐＧＥＸ－６ｐ－，获得重组质粒?ｐＥＴ－３２ａ－ＰＤＣｏＶ－Ｎ－Ｏｐｔｉ?和?ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ－ＰＤＣｏＶ－Ｎ－Ｏｐｔｉ，如Ａ?＾＾ＴＯＣｏＶ－ＮＪＪｐｔｉ?Ｂ?ｕｃｐｒｏｍ？？??
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本文编号：2887460