检测血清4型禽腺病毒非结构蛋白22K、52K抗体的ELISA方法建立及应用

发布时间：2020-11-17 16:29

　　 血清4型禽腺病毒(FAdV-4)属于禽腺病毒属。近年来,国内鸡群由FAdV-4引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。FAdV-4不仅感染3-7周龄肉鸡,还感染10-20周龄的蛋鸡,给养鸡业造成了巨大的经济损失。由于灭活疫苗的研制及应用,今后如何来鉴别鸡群是自然感染还是处于免疫状态,对FAdV-4有效及时防控至关重要。本研究以FAdV-4的非结构蛋白中的22K和52K为靶点,通过多肽合成,建立分别检测22K和52K蛋白抗体的基于多肽表位的ELISA方法,并评价其能否用于区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群。1.检测FAdV-4非结构蛋白22K、52K抗体的ELISA方法建立为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群,本研究在利用DNA Star对FAdV-4非结构蛋白22K及52K进行抗原性分析的基础上,进行了多肽合成、筛选,并建立了检测22K及52K蛋白抗体的ELISA方法。多肽筛选结果发现,22K-4P和52K-4P合成多肽与FAdV-4阳性血清反应性最佳。通过条件优化,分别建立了基于22K-4P和52K-4P多肽的检测 FAdV-4 抗体的 ELISA 方法,22K-4P-ELISA 以及 52K-4P-ELISA。22K-4P-ELISA 以及52K-4P-ELISA的CUT-OFF值分别为0.1668以及0.182。特异性试验证明所建立的两个ELISA仅与FAdV-4多抗血清反应,而不与所检测的抗其它禽类病毒包括鸡贫血病毒(CAV)、血清8型禽腺病毒(FAdV-8)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)的多抗血清反应。重复性试验表明所建立的两个ELISA的批内及批间的变异系数均小于10%。检测FAdV-4抗体的22K-4P-ELISA以及52K-4P-ELISA方法的建立,为区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群提供了技术可能。2.检测FAdV-4非结构蛋白22K、52K抗体的ELISA方法的初步应用为评价所建立的22K-4P-ELISA以及52K-4P-ELISA方法能否用于区分检测自然感染鸡群与灭活疫苗免疫鸡群,将22K-4P-ELISA以及52K-4P-ELISA对FAdV-4人工感染鸡群,临床发病鸡群以及灭活疫苗免疫鸡群血清进行了检测:并与基于结构蛋白Fiber2的检测FAdV-4抗体的ELISA以及IFA方法进行了比较。检测结果表明:在检测24份FAdV-4人工感染鸡群鸡血清样品时,22K-4P-ELISA,52K-4P-ELISA,F2-ELISA和IFA的阳性率分别为87.5%、95.8%、100%和100%;在检测189份临床发病鸡群鸡血清样品时,22K-4P-ELISA,52K-4P-ELISA,F2-ELISA 和 IFA 的阳性率分别为 85.7%、88.9%、96.3%和93.7%;在检测81灭活疫苗免疫鸡群血清中,22K-4P-ELISA,52K-4P-ELISA,F2-ELISA和IFA的阳性率分别为2.5%,0%,100%和100%。以上结果表明,本研究建立的22K-4P-ELISA和52K-4P-ELISA方法可以鉴别鸡群是FAdV-4自然感染还是处于FAdV-4灭活疫苗免疫状态,可为FAdV-4的防控与净化提供技术支撑。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

图１－２?５２Ｋ抗原性分析??

冬令?冬多?冬冬??５２Ｋ多肽编号??图１－４?５２Ｋ非结构蛋白分段后的多肽与血清的反应??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｐｅｐｔｉｄｅｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍ?５２Ｋ?ａｎｄ?ｓｅｒｕｍ??３．３间接ＥＬＩＳＡ方法的建立及优化??３．３．１最佳封闭及稀释液的选择??封闭液及待检血清稀释液分别为２％?ＢＳＡ／２％?ＢＳＡ、８％?ＲＳ／８％?ＲＳ、５％脱脂乳＋１％小??牛血清／Ｉ％脱脂乳稀释和５％脱脂乳＋１％小牛血清／ＰＢＳＴ稀释时，２２Ｋ－４Ｐ多肽最佳封闭及稀??释液的选择结果见表１－３，图１－５；?５２Ｋ－４Ｐ多肽最佳封闭及稀释液的选择结果见表１－４，图??１－６。从表格以及图中数据可见，２２Ｋ－４Ｐ多肽和５２Ｋ－４Ｐ多肽用２％ＢＳＡ作为封闭、稀释液??时非特异性较低

?ｉｎｉ??＿?ｚ?／?／?／??／?／?ｖ??血清来源??图１－６?５２Ｋ－４Ｐ多肽最侦封闭及稀释液的选择??Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｏｐｔｉｍａｌ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｂｌｏｃｋｉｎｇ?ａｎｄ?ｄｉｌｕｔｉｏｎ?ｆｏｒ?５２Ｋ－４Ｐ??３．３．２最佳封闭时间的确定??按照５卜ｉｇ／ｍｌ的抗原浓度进行包被酶标板，用２％?ＢＳＡ封闭液进行封闭，封闭时间设立??以下几个时间（３０ｍｉｎ、ｌｈ、２ｈ、３ｈ）。按间接ＥＵＳＡ程序进行试验，测定其〇Ｄ４５０ｎｍ值，??并计算ＯＤ４５０ｎｍ的平均值，结果显示封闭时间ｌｈ时，Ｐ／Ｎ值最大，封闭效果最好。因此，??最佳封闭时间为］ｈ。具体结果见表１－５，图１－７。??
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本文编号：2887702