宿主因子DENND1B影响流感病毒复制的机制研究

发布时间：2020-11-17 22:29

　　 流感病毒属于正黏病毒科,是引起哺乳动物、家禽疾病和死亡的重要病原之一。根据流感病毒NP蛋白和M蛋白的抗原差异,可以将其分为A型、B型、C型以及D型流感病毒。A型流感病毒除感染人外还能感染其它动物,如禽、马、猪、海豹等,B型和C型主要感染人,而D型流感病毒仅有部分牛感染病例。A型流感病毒的自然宿主是水禽,同时其对人和哺乳动物也具有较大危害,A型流感病毒经常以流行的形式出现,甚至引起流感大流行,给全球经济以及公共卫生安全造成了极大的威胁。疫苗免疫仍是防治流感病毒感染最有效的措施,但是由于流感病毒HA蛋白易于发生突变,使得每1-3年就需要更新疫苗株,给流感病毒的疫苗研制与使用推广带来极大的障碍。为此深入研究流感病毒的复制周期,对寻找新的保守的抗流感病毒靶标,进而研制新的抗流感病毒药物具有重要意义。本实验室利用siRNA全基因组文库筛选影响流感病毒复制的宿主因子,获得宿主因子——包含DENN结构域蛋白1B(DENN Domain-containing protein 1B,DENND1B),在此基础上,通过siRNA干扰和CRISPR Cas9系统验证siRNA筛选结果,并通过慢病毒介导的过表达系统以及逆转录病毒介导的过表达系统,验证了宿主因子DENND1B正调控流感病毒的复制,进一步研究发现宿主因子DENND1B调控病毒复制的关键区域是N端结构域。同时,我们研究发现宿主因子DENND1B能够与流感病毒PB1蛋白以及PA蛋白相互作用,其作用的关键区域是DENND1B的C端结构域。深入研究结果表明,流感病毒感染诱导AP2B1亚细胞定位改变,DENND1B能够调控AP2B1蛋白的表达以及细胞定位。此外,上调宿主因子DENND1B表达后,能够加速病毒感染早期AP2B1、DENND1B以及NP蛋白指示的流感病毒向细胞膜的聚集以及共定位,表明宿主因子DENND1B主要通过影响内吞环节来影响流感病毒复制。本研究初步揭示了宿主因子DENND1B调控流感病毒感染后内吞环节的分子机制,丰富了宿主因子与病毒蛋白互作网络,深化了对流感病毒复制周期的理解。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

国农业科学院硕士论文 第二章 宿主因子 DENND1B 正调控流感病毒的复制.3 实验结果.3.1 DENND1B 下调效果检测我们分别将 Scrambled siRNA、siRNA-1、siRNA-2 以及 siRNA-3 转染 A549 细胞，48 h 后收细胞提取 RNA，反转录后进行 qPCR 检测。经分析三条 siRNA 均能下调 DENND1B 基因的转水平，siRNA-1、siRNA-2 以及 siRNA-3 分别下调 DENND1B 基因转录水平 89%、44%、53%，iRNA-1 下调 DENND1B 基因表达效果最明显(图 2.1)。同时我们利用 CRISPR Cas9 构建ENND1B 的敲除细胞系，将 DENND1B 外显子区域敲除后，经验证成功敲除 DENND1B 基因(图.2)。

将 DENND1B 外显子区域敲除后，经验证成功敲除 DENND1B 基因(图2.2)。2.3.2 下调 DENND1B 抑制流感病毒复制根据 DENND1B 干扰下调结果显示，DENND1B siRNA-1 下调 DENND1B 转录水平最明显，所以我们选择 siRNA-1 进行后续实验。通过 siRNA 干扰后感染 WSN 流感病毒，我们发现干扰图 2.1 荧光定量 PCR 检测 DENND1B 基因 siRNA 干扰效果Fig. 2.1 siRNA knockdown of DENND1Bdetected by qPCR in A549 cells图 2.2 荧光定量 PCR 检测 DENND1B基因敲除效果Fig. 2.2 The expresion of DENND1B detectedby qPCR in Ko_DENND1B cells图 2.3 siRNA 干扰下调 DENND1B 表达抑制流感病毒复制Fig. 2.3 siRNA knockdown of DENND1Bdecreases IAV replication.图 2.4 敲除下调 DENND1B 表达抑制流感病毒复制Fig. 2.4 Knockout of DENND1Bby CRISPR Cas9 decreases IAV replication.

.2 下调 DENND1B 抑制流感病毒复制根据 DENND1B 干扰下调结果显示，DENND1B siRNA-1 下调 DENND1B 转录水平最明显，我们选择 siRNA-1 进行后续实验。通过 siRNA 干扰后感染 WSN 流感病毒，我们发现干扰图 2.1 荧光定量 PCR 检测 DENND1B 基因 siRNA 干扰效果Fig. 2.1 siRNA knockdown of DENND1Bdetected by qPCR in A549 cells图 2.2 荧光定量 PCR 检测 DENND1B基因敲除效果Fig. 2.2 The expresion of DENND1B detectedby qPCR in Ko_DENND1B cells
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本文编号：2887995