动物源大肠杆菌多粘菌素耐药基因mcr-1的流行病学及传播机制研究

发布时间：2020-11-18 02:22

　　 抗菌药物是人类和动物对抗细菌感染最重要的武器,然而由于抗菌药物的大量不合理使用,细菌耐药性问题已成为21世纪全球公共卫生和食品安全最大的威胁之一。在过去的几十年,新型抗菌药物的研发速度迟缓,而细菌的耐药性却不断出现。多粘菌素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,由于可转移的多粘菌素耐药基因mcr-1的发现,使得多粘菌素耐药性问题引起世界范围的广泛关注。目前,虽然有我国部分地区动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况的研究报道,但对mcr-1在我国的流行特征和传播机制仍缺乏了解。本研究拟在调查我国东北地区动物源大肠杆菌中mcr-1流行情况的基础上,进一步阐明mcr-1基因在动物源大肠杆菌中的传播机制。本研究分析了2016年6月至2016年9月从东北三省分离的猪源、鸡源和奶牛源大肠杆菌mcr-1的携带和流行情况,结果发现鸡源和猪源大肠杆菌的mcr-1携带率明显高于奶牛源大肠杆菌的携带率,并显示绝大多数mcr-1阳性分离菌对多种抗生素耐药,特别是对四环素、氟苯尼考和环丙沙星,多重耐药性十分严峻。利用两种分子分型方法探讨了mcr-1阳性分离菌的分子流行特点,结果显示mcr-1阳性分离菌的PFGE谱型和MLST序列型具有显著的多样性,菌株间的亲缘关系较远。分析了mcr-1在分离菌中的定位情况、接合转移能力、接合转移频率以及质粒稳定性,结果显示,mcr-1基因在质粒和染色体上均有分布,但主要定位于大小不等的质粒上,质粒大小在~30kb至~430kb之间,质粒分型结果发现五种不同类型的mcr-1阳性质粒,其中以IncX4型、IncI2型和IncHI2型三种质粒为主,接合转移频率范围在1.4×10~(-6)-8.8×10~(-2)之间,稳定性试验表明五种不同类型的质粒均能稳定存在于受体菌中。通过对分离菌基因组草图和代表性质粒全序列进行测定,结果显示本研究五种代表性质粒与国内报道的相应类型质粒序列具有较高的同源性,表明这些质粒已在我国多个地区流行。同时,通过全基因组测序分析首次发现了携带mcr-1的毒力—耐药杂合质粒,推测其可能是由IncHI2型耐药质粒与IncF型毒力质粒通过同源重组的方式融合而成。此外,对mcr-1基因环境研究发现,Tn6330转座子是介导mcr-1基因在不同类型质粒间以及染色体上传播的主要方式。对分离株中mcr-1基因序列对比发现两个新的mcr-1突变体,功能研究显示突变没有改变MCR-1蛋白的催化活性,表明突变的两个位点不是决定其功能的关键氨基酸残基。本研究为揭示mcr-1在动物源大肠杆菌中的传播机制,为多粘菌素耐药菌及耐药基因转移扩散的风险评估和防控提供科学依据。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

.1 多粘菌素的结构多粘菌素（Polymyxin）是一组从多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）培养液中提肽类抗生素，其中包含多粘菌素 A、B、C、D、E 5 种组分。迄今为止，只有多粘菌素 B菌素 E（又称粘杆菌素）应用于临床。多粘菌素类抗生素发现于 1949 年，在日本首次分，1959 年开始在欧洲、美国和中国等国家广泛应用于医学临床和畜牧业。但由于多粘菌素窄且对肾脏和神经系统有较大的毒性作用，同时由于新一代疗效好、毒性低的广谱抗生素代头孢菌素）的问世，限制了多粘菌素类药物在人医临床上的使用(Li et al., 2006)。直到上 年代，随着多重耐药（Muti-drug resistance，MDR）和泛耐药（Pan-drug resistance，PDR氏阴性菌，特别是耐碳青霉烯肠杆菌的出现，在缺乏新抗菌药物的情况下，人们不得不重多粘菌素类药物，将其作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的 最后一道防线 (Falagas11)。多粘菌素属于阳离子多肽类抗生素，非核糖体合成，其结构是由线性的三肽部分连接肪酰基链和环状7肽构成，4-位的L-α,γ-二氨基丁酸残基（L-α,γ-diaminobutyric acid，L-D 10 位的 L-苏氨酸（Thr）缩合后形成七肽环。多粘菌素 B 与多粘菌素 E 基本结构相同，于 7 肽环上的 6-位氨基酸不同。多粘菌素 B 的 6-位氨基酸是 D-Phe，多粘菌素 E 的 6-位氨 D-Leu（图 1.1）。

国农业科学院博士学位论文 第一章其它的家族成员一样具有相似的抗菌机制。尽管详细的多粘菌素抗菌机理还不十分清楚认为造成细胞膜裂解是其中重要的途径之一。多粘菌素的抗菌机制与其两个特殊的结构：（a）一个由 7 个氨基酸残基组成的亲水性环状多肽 头部 ，（b）一个长的疏水性脂 ，通过三个氨基酸残基从 头部 延伸出来。组成多粘菌素的十个氨基酸中六个是 L氨基丁酸残基（L-DAB），它们都集中于亲水性 头部 ，在生理 pH 条件下，可以提电荷。多粘菌素的作用靶点是革兰氏阴性菌细胞外膜上的脂多糖（Lipopolysaccharide，L多糖 （LPS）主要包括核心多糖、O-抗原和类脂 A（LipidA），其中 Lipid A 通过结合和 O-抗原以保持细胞外膜的完整性。多粘菌素发挥抗菌活性的主要驱动力是多粘菌素膜之间的相互作用，即多粘菌素带正电荷的阳离子 头部 与 Lipid A 带负电荷的阴离团之间的静电吸引作用。一旦与 Lipid A 结合，多粘菌素的脂类 尾部 就会穿透细胞致细胞外膜结构紊乱，增加细胞膜的通透性，进而破坏细胞膜的物理完整性，使细胞膜失衡，造成细胞内重要成分丢失，最终导致细菌裂解和死亡（图 1.2）。

图 1.3 双组分系统介导的多粘菌素耐药示意图(Baron et al., 2016)Fig. 1.3 Two-component system-mediated polymyxin resistance1 基因的发现究认为，多粘菌素耐药的产生是由细菌染色体突变所介导的，因此无法通素耐药，因而多粘菌素耐药菌不易形成广泛性流行。2007 年华南农业大学
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