猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体制备及E2基因微环DNA载体质粒初步研究

发布时间：2020-11-18 10:55

　　 猪瘟(CSF)是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪群疫病,每年对养猪业造成巨大损失。为了解2016-2017年度山东省CSF流行清况,本文对2016-2017年度CSF抗原、抗体进行检测。2016年共检测疑似CSF感染组织样品2297份,其中检测到阳性结果样本数为230份,阳性率为10.01%。2017年共检测疑似CSF感染组织样品784份,其中检测到阳性结果样本数为67份,阳性率为8.55%。2016年共检测血液抗体样品9713份,其中CSF阳性抗体样本数为7744份,阳性率为79.73%。2017年共检测血液抗体样品6887份,其中CSF阳性抗体样本数为5839份,阳性率为84.78%。检测结果显示,2017年相较于2016年抗原感染率下降,抗体阳性率上升。对2016-2017年送检样品中的抗原阳性病料,根据地域和时间差异进行毒株分离,最终分离到8株CSFV野毒株,将所有分离毒株E2基因进行序列遗传进化分析,结果显示8株野毒株均为2.1d基因亚群,表明目前在山东省内广泛、持续性的存在2.1d基因亚群CSFV。同时,本研究对野毒株SDWF 2016进行了全基因组序列测定。单克隆抗体因为其特异性和敏感性良好等优点,在CSFV的诊断以及分子生物学研究方面有重要作用。本文根据分离毒株SDWF 2016的E2基因主要抗原区段,构建质粒进行原核表达蛋白免疫小鼠制备CSFV单抗。得到2株效价1:80000的IgGI型腹水单抗2-77、4-35,稀释800倍用于IFA试验,可以很好地鉴别CSFV的感染。单抗的成功制备,为实验室鉴定CSFV及后续试验的开展提供了基础。普通细菌载体质粒存在将自身DNA与宿主染色体整合的潜在危险,微环DNA载体(Minicircle DNA Vectors)可通过位点特异重组酶对载体质粒进行切割重组,并通过宿主体内特异性酶的作用,形成含有目的基因及表达所需原件的微环DNA质粒,缩短了载体质粒片段长度,减小了整合的潜在危险。本试验根据分离毒株SDWF 2016基因组序列,构建猪瘟病毒E2基因去跨膜区(dTMR)的微环DNA载体质粒pMC-E2d-PP、pMC-E2d-MC,用其对小鼠进行免疫,分析其体液免疫水平和细胞免疫水平。结果显示在免疫后第5周,试验组pMC-E2d-MC抗体水平呈现阳性,流式细胞术检测CSFV特异性CD8+T细胞,及细胞因子IFN-γ、IL-4 增值率分别为 10.67%,1.98%,0.722%,表明 CSFV 微环 DNA 质粒可以引起体液免疫应答和细胞免疫应答。本研究为CSFV新型疫苗的研发提供了新思路和基础数据。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

图１．１?ＣＳＦＶ粒子和基因组结构示意图（Ｂｅｅｒ?，?２００７）??１．１．２．１?ＣＳＦＶ结构蛋白及其功能??核衣壳蛋白Ｃ（Ｃｏｒｅ），其Ｎ端１６９Ｓｅｒ是蛋白水解酶Ｎｐｒｏ的作用位点，通２６７Ａｌａ信号肽酶（ＳＰ）的作用位点与糖蛋白Ｅ０连接。成熟的Ｃ蛋白由９９个氨酸残基组成，含Ｌｓｙ和Ａｒｇ等碱性氨基酸比例较高，其大小约为１４?ｋＤａ（ＭｅｙｅｒＳ?，１９８９；?Ｔｈｉｅｌ?，?１９９１?；Ｈｅｉｍａｎｎ?，?２００６）。有研究表明它对病毒复制过程中病毒基因ＲＮＡ结构重排、包装和病毒粒子形态形成和感染发挥作用（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，?１９９６Ｉｖａｎｙｉ，２００８）。??囊膜糖蛋白Ｅ０?（Ｅｍｓ）是ＣＳＦＶ编码的蛋白中结构和功能都比较独特的一个白，具有ＲＮａｓｅ活性，因此又称Ｅｍｓ。它能够经过多步ＲＮＡ多核苷酸基质的合、裂解过程，产生线性３’单核苷酸（Ｋｒｅｙｅｔａｌ．，２０１２）。Ｅ０蛋白通过Ｎ端２６８ｇｉｕ与Ｃｏｒｅ相连，通过４９４Ａｉａ与Ｅｌ蛋白相连，共有ａａ残基２２７个，其大小约４４－４８ｋＤａ。成熟的Ｅ０蛋白是以由二硫键连接而成的同源二聚体形式（Ｒｉｉｍｅｎａｐｆ，

通过位点特异重组酶在普通质粒体内表达，对ａｔｔＢ和ａｔｔＰ重组位点??进行识别，介导发生重组，得到只含有目的基因表达所必须的表达框的微环ＤＮＡ??载体（图１．３），缩短了载体片段长度，降低不利效应发生的概率。??＾ｉｎｉｄｒｃｌｅ＾??ＭＬ?｜＾Ｐｌｗｎｏｔｏｆ?．?ｂ?雜潑微奶??一?＞：—??（ｗｎｉＫＨｎ?０Ｘ４Ｘ３１?Ｉｍｅｖｃａｅ??Ｍｒｔ?Ｓ（＊－ｌ?ｔｎｄｏｎｕｃｕｗｓ＊?ｑ＾＞％）??、?Ｋ?２?ｄａｙｓ?８ｄａＶｓ??游？戀１邏??Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ??图１．３：微环ＤＮＡ形成及持续表达示意图（Ｓｙｓｔｅｍ?Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，?Ｉｎｃ；２０１０）??研究表明在ＰＢＡＤ／ａｒａ?Ｃ阿拉伯糖系统内，在无诱导状态下重组酶的表达会??被抑制，将含有目的基因的重组亲本质粒（Ｐａｒｅｎｔａｌ?Ｐｌａｓｍｉｄ；ＰＰ）转入特定能同时产??生重组酶和Ｓｅｅｌ核酸内切酶的大肠杆菌（Ｋａｙ?ｅｔａｌ．，２０１０）中，使其进行克隆扩增，??再用阿拉伯糖对其进行诱导，使重组酶发挥作用，对ＰＰ质粒进行切割重组，形??成含有目的基因和表达原件的重组微环质粒（Ｍｉｎｉｃｉｃｒｙ?；ＭＣ）和细菌骨架??（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ?Ｂａｃｋｂｏｎｅ?；ＢＢ）?ＤＮＡ。细菌骨架含有Ｓｅｅｌ核酸内切酶位点，在宿主大??肠杆菌表达的Ｓｅｅｌ核酸内切酶的作用下被线性化；而含有目的基因没有Ｓｅｅｌ核??酸内切酶位点的微环ＤＮＡ得以保留下来。近些年，人们也研宄出来了无需特定??菌种

为阴性对照，１－６送检伟品，其中１、２、３、６为阳性吉果；４、；＞为阴性结果。??本试验检测了?２０１６年１月到２０１７年１２月期间送检疑似猪瘟感染样品，按季??度对送检样品和阳性样品数据进行统计，显示如下图２－２。??〇??（Ｄ?ｍ?－３＊?ｄｉ?丨??§?．?士?ＲｉｈＨＡ??ｉｉ／??Ｉ?－??〇?ｒ?，?ｔ－ｒ￣ｔ?ｔ￣￣￣？?—＜?■??ｉ?？＂；」ｆ＇ｉ?：ｊｆ＂ｊ?：ｆ＂ｉ?Ｉ?ｉｆ＂；?：ｆ＂；?ｓｆｉｔ?．ｉｆ乂｜??２０１６?年?一｜—?２０１７年?一｜??：．」??：－＇ｉ６?１?：：．ｒ???Ｖｌ＇＂?？—，ａ?．＃二ｓ＊?ｔ．Ｅ＇ｉｓｔ?ｊ?．ｙ．ｓ￥ｇ?｜?￥－ｉ，ｔ?ｓ二％ｉｔ，ｔ?ｙ．ａ？ａ?｜??ｉ？？ｆｉ?ｌｉ?５６Ｓ?：：ｉ?ｊ?：Ａ１?１３０１?ｌｉｉ￣＂？７?ＵＳ??＾ＢＨｉＳ?］〇?：－ｉ〇?１３?ｊ?１０?｜?：ｊ?；６?Ｊ?１３＿??图２－２?：?ＣＳＦＶ２０１６－２０１＿年抗原检测样本及阳性样本数量统计图??Ｆｉｇ２－２?：?Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?ＣＳＦＶ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｔｅｓｔ?ｏｎ?２０１６－２０１７??２０１６年第１季度检测样品２３６份，阳性样本数为１０份，阳性率为４．２４％；??第２季度检测样品５６８份，阳性样本数为９０份，阳性率为１５．８５％；第３季度检??测样品２２１份，阳性样本数为１０份，阳性率为４．５２％；第４季度检测样品２４７??份，阳性样本数为１０份，阳性率为４．０５％。??２０１７年第１季度检测样品３０１份，阳性样本数为２４份，阳性率为７．９７％；??第２季度检测样品２３８份
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 王琴;;猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究[J];中国农业科技导报;2006年05期

2 韩岳,王希良;DNA疫苗的免疫机制及其优化策略[J];医学分子生物学杂志;2005年02期

3 余兴龙,涂长春,李红卫,陈创夫,李作生,马正海,孙明,殷震;猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究[J];中国病毒学;2000年03期

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1 曹志;猪瘟病毒及其非结构蛋白对猪巨噬细胞Toll样受体介导天然免疫应答的影响[D];西北农林科技大学;2015年

本文编号：2888642