弓形虫RH-ΔTgcsp2虫株的构建及其表型和转录组研究

发布时间：2020-11-18 22:44

　　 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种重要的人畜共患病原体,免疫功能缺陷的人或者动物感染后会引起急性临床症状,如发烧、肺炎和心肌炎等。此外,弓形虫能够通过孕妇或者孕畜发生垂直传播,引起胎儿脑炎、视网膜炎甚至更严重的后果。为研制出安全有效的疫苗,目前已开展了多种弓形虫毒力相关蛋白的研究,如致密颗粒蛋白(dense granules,GRAs)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)等。研究发现,冷休克蛋白(Cold Shock Proteins,CSPs)在细菌、植物和动物细胞中能够调节转录和翻译过程,在沙门菌(Salmonella)等病原入侵宿主细胞的过程中,CspC和CspE参与调控基因的表达,而且在细菌的运动性、膜形成和毒力方面发挥重要作用。此外,CSPs对植物细胞的生长发育和动物细胞的增殖和迁移都发挥着重要作用。但是,目前尚没有关于弓形虫CSPs的研究。基于此,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫冷休克蛋白Tgcsp2基因缺失株,通过探究其表型及转录组的变化来分析弓形虫Tgcsp2基因的功能。1.成功构建了弓形虫Tgcsp2基因缺失株(RH-ΔTgcsp2):本研究利用CRISPR/Cas9技术在弓形虫RH速殖子的靶基因中插入了抗性片段,药物筛选后通过诊断PCR和荧光定量PCR进行鉴定发现,与RH野生株相比,RH-ΔTgcsp2虫株的Tgcsp2基因确有抗性片段的插入。2.研究了弓形虫RH-ΔTgcsp2虫株的表型:将体外培养的弓形虫RH速殖子和RH-ΔTgcsp2速殖子分别感染人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblast,HFF),发现RH-ΔTgcsp2虫株形成的空斑数较RH株少,且空斑较小;将不同剂量的虫体接种于长满HFF细胞的96孔板中,发现RH-ΔTgcsp2株对宿主细胞造成的裂解程度明显小于野生株;间接免疫荧光试验发现RH-ΔTgcsp2速殖子的入侵率少于RH速殖子,Tgcsp2基因的缺失影响弓形虫在宿主细胞内的增殖能力,并且RH-ΔTgcsp2虫株的逸出能力也有所减弱;动物试验发现RH-ΔTgcsp2虫株感染的小鼠比野生型RH虫株感染的小鼠存活时间长。3.获得了弓形虫RH-ΔTgcsp2虫株的转录组:为了进一步探究Tgcsp2基因的缺失对RH虫株基因表达的影响,本研究利用RNA-seq技术对RH-ΔTgcsp2虫株和RH野生株进行转录组测序,结果发现,在RH-ΔTgcsp2虫株和RH虫株分别有7392个和7492个基因表达;与RH株相比,有169个基因只在RH-?Tgcsp2虫株中特异表达,有5000个基因在该虫株中差异表达(上调转录本有2582个,下调转录本有2418个),但有269个基因不表达。功能分析发现差异表达基因富集于3873个GO条目和72条KEGG通路中,GO分析发现它们可能主要参与代谢、催化和生物合成的调节,而KEGG分析发现它们可能与蛋白质加工、蛋白酶体、DNA复制、生物合成和弓形虫病发生等相关。综上所述,本研究发现Tgcsp2基因的缺失会减弱弓形虫RH虫株的入侵、胞内增殖和逸出能力,并减弱RH虫株对小鼠的毒力。转录组分析发现,这些变化可能与其基因表达相关。这些研究结果为深入研究TgCSP2蛋白的作用机制奠定了基础,为设计弓形虫致弱虫株疫苗提供了理论依据。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.72
【部分图文】：

0；1. pSAG1::CAS9-U6::sgTgc. The plasmid pSAG1::CAS9-U62-1 pSAG1::CAS9-U6::Tgcsp2 1 The plasmid pSAG1::CAS9-U6扩增结果现目的条带与 DHFR*抗性标

s9系统构建RH- Tgcsp2虫株的示意图；b. PCR鉴定m of constructing RH- Tgcsp2 strain using the CRISidentification; c. Real-time PCR identification图 2-3 RH-ΔTgcsp2虫株的构建及鉴定. 2-3 Generation and identification of RH-ΔTgcsp2 s果Tgcsp2速殖子感染HFF细胞后发现，RH-ΔT量显著减少（P<0.01）（图2-4）。

图 2-5 RH-ΔTgcsp2与RH虫株对HFF细胞的裂解情况Fig. 2-5 HFF cell lysis of RH-ΔTgcsp2 and RH strain注：*代表 P<0.05，***代表P<0.001Note: *means P<0.05, ***means P<0.001果光对野生型RH株和RH-ΔTgcsp2进行入侵试验发生型RH株（图2-6b）。
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本文编号：2889312