白藜芦醇对鸡肝细胞脂肪变性PPARα信号通路的调控机理及PPARα慢病毒过表达载体的构建

发布时间：2020-11-19 00:34

　　 为探讨白藜芦醇对蛋鸡肝细胞脂肪变性PPARα信号通路的调控机理,通过改良原位二步灌流法获得了高活性蛋鸡原代肝细胞,依据人体非酒精性脂肪肝等体外模型,使用混合脂肪酸(油酸:棕榈酸为2:1)处理肝细胞建立脂肪变性模型,分为四组,分别为Control组(正常培养的原代肝细胞)、FA组(Control组+1.0 mM脂肪酸)、FA+Res组(FA组+80μM白藜芦醇)、Con+Res组(Control组+80μM白藜芦醇)。然后测定细胞活性,抗氧化指标(SOD、MDA),脂质相关指标(TG、TC、HDL-ch、LDL-ch),凋亡基因(Bcl-2、BAX、Caspaes-3)以及PPARα信号通路相关基因(ADFP、FABP1、FABP3、PPARα、Srebp-1c、Apo-A1、Apo-B100、SCD-1)mRNA表达量,此外,还利用慢病毒构建过表达载体从而使肝细胞中PPARα基因过表达,结果如下:(1)通过细胞活性检测及脂质相关指标检测,确定当培养基中添加1.0 mM脂肪酸48h时,为最佳造模条件,在添加0.5-1.2mM的脂肪酸时,相比于Control组,TG含量均极显著上升(P0.01)。(2)与Control组相比,FA组SOD活性极显著下降,且MDA含量显著升高(P0.05),而FA+Res组情况明显得到改善;与Control组相比,FA组TG和TC含量极显著升高(P0.01),而与FA组比较,FA+Res组TG和TC含量极显著下降(P0.01)。(3)与Control组相比,FA组BAX、Caspase-3显著上升(P0.05),而Bcl-2mRNA含量显著下降(P0.05)。与FA组相比,FA+Res组Caspase-3 mRNA含量显著下降(P0.05)。(4)与Control组相比,FA组ADFP、FABP1、FABP3、Srebp-1c、Apo-A1 mRNA含量极显著上升(P0.01);PPARα、Apo-B100、SCD-1 mRNA含量显著下降(P0.05或P0.01),与FA组相比,FA+Res组Srebp-1c、FABP1、FABP3、ADFP均极显著下降(P0.01)。(5)PPARα慢病毒过表达的转染效果:MOI值为125及以下时显示无荧光,而MOI值达到150及以上时出现绿色荧光,但是原代肝细胞转染效率极低,没有达到预期值;选择传代PK-15细胞进行检验,在MOI达到5时,转染效率达80%以上。综上所述:本实验成功建立了由1mM脂肪酸(棕榈酸:油酸=2:1)诱导的蛋鸡原代肝细胞脂肪变性模型。白藜芦醇能够通过调控蛋鸡肝细胞脂肪变性PPARα信号通路相关基因的表达来改善脂质沉积水平。
【学位单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：

扩增电泳图，M 为 mark，1 为退火温度 60.8 ℃结果，2 为退火温度 59.7 ℃退火温度 58.3 ℃结果，4 为退火温度 57.2 ℃结果CR amplified electrophoresis map, M is mark, 1 is the annealing temperature of ealing temperature of 59.7 ℃, 3 is the annealing temperature of 58.3 ℃, 4 is thetemperature of 57.2 ℃PCR 拼接 1：所有的 Oligo 进行 PCR 拼接，在目的位置切割胶回收胶回收试剂盒回收纯化（按照胶回收试剂盒说明书操作）。PCR 拼接 2：以割胶纯化产物为模板，目的序列最两端的 Oligo 为CR 拼接，在目的条带位置进行割胶回收纯化，OD 测定质检和定双酶切。表 2-3 酶切体系Table 2-3 Enzyme digestion system溶液组分 体积10×内切酶 Buffer 5.0 μLPCR 纯化产物 1 μg

图 1-2 慢病毒包装流程Fig 1-2 Lentivirus packaging process慢病毒载体和包装质粒一起转染 293T 细胞，包装病毒，收集病毒缩，然后用荧光法测定其滴度。取细胞状态良好且处于对数生长期的 293T 细胞，用胰酶（0.2 %）基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每个 10 cm 的培养皿 6×培养皿中，培养箱中培养过夜；第二天确认细胞状态。并在转染前移去培养液，换 5 ml Opti-MEM：取 9 μg Packaging Mix 和 3 μg 慢病毒表达质粒加入 1.5 ml Opti-）中，轻轻混匀；Lipo 稀释：取 36 μl lipofectamine 2000 加入另外的 1.5 ml Opti-ME室温放置 5 min；轻轻混合质粒溶液（1.3）和 lipofectamine 2000 稀释液（1.4），置室转染：将 3 ml 质粒脂质体复合物（1.5）小心地加入到细胞培养皿于培养箱（37 ℃，5% CO2）中孵育 6 个小时后，更换完全培养液 DM

18图 2-1 蛋鸡原代肝细胞不同倍数及时间的形态学观察A：100 （0 h）；B：200 （0 h）；C：100 （3.5 h）；D：200 （3.5 h）；E：100 （24 h）；F：200 （24 h）Fig 2-1 Morphological observation for primary hepatocytes of laying hens in different magnification andtime.A：100 (0 h)；B：200 (0 h)；C：100 (4 h)；D：200 (4 h)；E：100 (24 h)；F：200 (24 h)
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本文编号：2889433