NOD2在绵羊肺炎支原体诱导巨噬细胞自噬中的作用机制

发布时间：2020-11-20 06:04

　　 绵羊肺炎支原体(Mycoplasna ovipneumoniae，MO)引起的绵羊传染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)对养羊业的发展造成严重的威胁。自噬是真核细胞中保守的降解途径,亦可降解侵入性病原体,在细胞的生存、抗感染免疫等方面起着重要作用。本实验室前期研究发现MO可以诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬,且自噬抑制了 MO在胞内的增殖。研究认为,核苷酸结合寡聚结构域蛋白2(nucleotidebindingoligamerization domain 2,NOD2)作为胞内模式识别受体,能够识别侵入的病原菌,诱导细胞自噬;并且可以通过激活JNK途径引发下游反应以抵抗病原菌感染。然而,在MO感染RAW264.7过程中,JNK-Bcl-2/Beclin1通路是否参与MO诱导的RAW264.7自噬;NOD2是否可以识别MO;在MO诱导的RAW264.7自噬过程中,NOD2与JNK-Bc1-2/Beclin1存在怎样的联系?相关问题,有待阐明。本研究首先采用MO感染RAW264.7细胞,通过激活、抑制或干扰NOD2,结合免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot和mRFP-GFP-LC3双荧光标记蛋白等技术,分别从形态学水平和分子水平,探讨NOD2对MO诱导RAW264.7细胞自噬的调控作用。通过上述实验,获得研究结果如下:1.MO感染RAW264.7细胞后,NOD1蛋白表达无显著差异;NOD2蛋白表达趋势与MO诱导的自噬水平相一致。激活NOD2后,自噬体与MO共定位数量增多;抑制NOD2后,结果相反。实验结果证实,NOD2参与MO诱导的RAW264.7自噬,而NOD1不参与此过程。2.MO感染RAW264.7细胞后,当过表达NOD2时,自噬流增强,自噬相关基因和蛋白Atg5、Atg7、Beclin1、LC311/1表达水平升高,且限制胞内MO的增殖;当NOD2表达被抑制时,结果相反。表明NOD2参与调控MO诱导的RAW264.7细胞自噬过程,并对MO在RAW264.7细胞中的增殖具有明显的影响。3.MO感染RAW264.7细胞后,胞内p-JNK1/2、LC3-I1/I表达量升高,自噬小体显著增多;当sp600126抑制JNK后,p-JNK1/2、LC3-Ⅱ/I表达量降低,自噬小体减少。结果证明JNK参与调控了 MO诱导的RAW264.7细胞自噬。4.MO感染RAW264.7细胞后,当过表达NOD2时,p-JNK、p-Bc1-2、Beclin1表达水平升高;而干扰NOD2后,结果相反,表明NOD2可以调控JNK通路。sp600126抑制JNK通路后,NOD2对MO诱导的RAW264.7细胞自噬不再具有调控作用。即NOD2调控MO诱导的RAW264.7自噬依赖于JNK-Bc1-2/Beclinl通路。研究结果表明,激活NOD2后促进MO诱导的R。AW264.7自噬,抑制/干扰NOD2后MO诱导的RAW264.7自噬水平降低,且NOD2通过调控RAW264.7自噬限制胞内MO增殖;进一步研究发现NOD2通过依赖性JNK-Bcl-2/Beclinl途径参与MO感染所诱导的RAW264.7 自噬。
【学位单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.62
【部分图文】：

与溶酶体融合降解货物的过程。微自噬通过溶酶体膜或液泡膜的变形直接包裹长寿命蛋白及??特定细胞器［４８］，并通过溶酶体在胞内降解［４９］。伴侣介导的自噬是调节特定的可溶性胞质蛋??白的选择性功能自噬，其选择性是由细胞质底物中的靶向基序ＫＦＥＲＱ所赋予的［５°］（图１－??２）。随着自噬研宄的深入，已经发现自噬可以在特定情况下特异性降解某些类型的大分子或??细胞器，这种自嗟被称为选择性自噬［５１］，包括线粒体自噬（Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ）、脂类自噬（Ｌｉｐｏｐｈａｇｙ）、??内质网自嗤（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｐｈａｇｙ）、异源自噻（Ｘｅｎｏｐｈａｇｙ）等［５２＿５４］，选择性自嗤依赖于特定的受??体蛋白来完成特定货物的吞噬作用，通常包括ＯＰＴＮ、ＮＢＲ１、ＮＤＰ５２、ＮＩＸ?（ＮＩＰ３样蛋白??Ｘ）和?ＦＵＮＤＣ１?（含有?１?个?ＦＵＮ１４?结构域）［５５’５６］。??＜ｌＪ＾ＫＦＥＲＱ?Ｍ〇ｔｌｆ?Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ?Ｎ．??／?Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?＼??／?ａｕｔｏｐｈａｇｙ?＼??ｌ?ＵＭＰ２Ａｇ＾Ｐ?＾＾?＼??ｌ繼命頌一?／??＼?Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ?Ｊ??Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ?＼??图１－２细胞自噬的分类［５７］??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｒｅｅ?ｔｙｐｅ?ｏｆ?ａｕｔｏｐｈａｇｙ＾５７＾??－３?－??

知细胞质中的微生物产物的ＰＲＲ。??ＮＬＲ家族根据它们的Ｎ－末端结构域的不同又分为五个亚家族：ＮＬＲＡ、ＮＬＲＢ、ＮＬＲＣ、??ＮＬＲＰ、ＮＬＲＸ?（图１＞４）。这些亚家族含有一个酸反式激活结构域，一个杆状病毒抑制剂重??复序列和一个半胱天冬酶募集结构域（ｃａｓｐａｓｅ－ｒｅｃｒｕｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ，?ＣＡＲＤ）或Ｐｙｒｉｎ结构域［８５］。??ＮＬＲＣ?亚族包括五种蛋白质：ＮＯＤＩ、ＮＯＤ２、ＮＬＲＣ３、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＣ５。??核苷酸结合寡聚结构域?１?（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｏｌｉｇａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ?１，?ＮＯＤＩ）和核昔??酸结合寡聚结构域?２?（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｏｌｉｇａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ?２，?ＮＯＤ２）蛋白是首先被识??别的ＮＬＲｓＰ＇也是家族中研宄最广泛的成员。ＮＯＤＩ蛋白含有９５３个氨基酸，分子量为??９７ｋＤａ；而ＮＯＤ２蛋白含有１０４０个氨基酸，分子量为１１０ｋＤ［８Ｓｌ。ＮＯＤ１和ＮＯＤ２具有相似??－６－??

宁夏大学硕士学位论文?第二章Ｎ０Ｄ２参与Ｍ０诱导的ＲＡＷ２６４．７细胞自噬过仪器名称????电泳仪?Ｐｏｗｅｒ?ｐａｃ?ＨＶ?美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公司??转膜仪?Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ?ＳＤ?Ｃｅｌｌ?美国?ＢＩＯ－ＲＡＤ?公司??酶标仪?６８０?美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公司??Ｃ０２培养箱?３１１?美国Ｔｈｅｒｍｏ公司??荧光倒置显微镜?ＡＥ３１?中国ＭＯＴＩＣ公司??正置荧光显微镜?ＤＭ２５００?德国Ｌｅｉｃａ公司??恒温震荡孵化仪?Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ?ｃｏｍｆｏｒｔ?德国ＥＰＦＥＮＤＯＲＦ公司??化学发光检测仪?Ｅ５３１１?美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司??Ｏｄｙｓｓｅｙ?Ｓａ?ＯＳＡ－０３１５?上海基因公司??２．２技术路线??ＭＯ诱导ＲＡＷ２６４．７细胞
【参考文献】

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2 彭虹;杨娇;胡荣贵;;泛素信号途径、自噬受体与细胞选择性自噬[J];生命的化学;2015年02期

3 冯旭飞;刀筱芳;张贤宇;李定霏;杨发龙;;绵羊肺炎支原体p128基因序列分析及原核表达[J];中国兽医杂志;2015年02期

4 刘菲;周光炎;路丽明;;胞内模式识别受体NLR的生物学特性及其在疾病中的作用[J];中国免疫学杂志;2014年12期

5 马臣杰;侯玉婷;李敏;何玉龙;何萍;张斯民;张文清;;绵羊肺炎支原体甘油代谢酶GlpO的表达、鉴定与纯化[J];黑龙江畜牧兽医;2014年23期

6 韩冰;杨琴;崔清华;;选择性自噬的研究进展[J];安徽农业科学;2014年25期

7 杨发龙;张焕容;汤承;岳华;;绵羊肺炎支原体p113基因的序列分析及功能预测[J];华南农业大学学报;2013年01期

8 孙雅婧;郭青龙;;细胞自噬的研究进展[J];药学与临床研究;2012年03期

9 赵红艳;刘文青;车腾飞;卢金华;宋静岚;赵宝华;;绵羊肺炎支原体Y98 P30基因的克隆、表达及免疫试验[J];中国兽医学报;2012年03期

10 许健;储岳峰;赵萍;高鹏程;贺英;剡根强;逯忠新;;中国部分地区绵羊肺炎支原体的基因多态性分析[J];畜牧兽医学报;2011年09期

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2 欧广利;核因子Nrf2负向调节肺炎支原体LAMPs诱导人THP-1细胞产生炎症物质[D];南华大学;2015年

本文编号：2891058