PRSS35在牛卵泡颗粒细胞中的表达及功能研究

发布时间：2020-11-20 19:32

　　 牛属于单胎动物,在牛的一个发情周期中,卵巢内一般只有一个卵泡会发育成熟并排卵,而卵巢上大量参与发育的卵泡则在其生长过程中就闭锁凋亡。排卵率低一直是限制牛,羊等单胎动物大规模繁育的关键因素。本课题组前期以母牛为研究对象,利用高通量深度测序技术筛选出10个与牛发情周期卵泡发育相关的基因,确定丝氨酸蛋白酶35(serine protease 35,PRSS35)与牛卵泡的发育相关。本试验以山西省文水县肉牛屠宰场海福特牛卵巢作为研究对象,首先扩增牛卵巢PRSS35基因CDS序列并进行生物信息学分析;接着筛选出牛优势卵泡与从属卵泡;对PRSS35蛋白在牛卵泡颗粒细胞中进行定位,接着从基因与蛋白两方面研究PRSS35对牛卵泡颗粒细胞的影响;最后通过基因沉默,siRNA转染颗粒细胞确定PRSS35基因在牛卵泡颗粒细胞生长发育中的作用,为探究PRSS35对牛卵泡发育过程中的作用奠定理论与实践基础。本试验的研究结果及结论如下:1.牛PRSS35基因CDS区序列全长1239 bp,编码412个氨基酸。其蛋白PRSS35等电点9.82,碱性蛋白,分子量46.5KDa,是一种不稳定亲水性分泌蛋白,具有长度为20个氨基酸的信号肽,11个O-糖基化位点、2个N-糖基化位点和3个磷酸化位点,有一个典型Tryp_Spc结构域,即胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。进化分析表明,牛与同为牛亚科水牛、以及牛科绵羊、山羊亲缘关系最近,与啮齿目大鼠和小鼠亲缘关系最远。2.对12头牛卵巢最大卵泡与第二大卵泡卵泡液进行ELISA激素测定,三头牛最大卵泡E2浓度显著高于第二大卵泡(P0.05),最大卵泡P4浓度显著低于第二大卵泡(P0.05)。12头牛共筛选出3头牛的最大卵泡和第二大卵泡分别为牛优势卵泡和从属卵泡。3.免疫组化分析表明,PRSS35在牛优势与从属卵泡颗粒层均有表达;荧光定量PCR结果显示PRSS35mRNA在牛优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于从属卵泡(P0.001);Western Blot结果显示PRSS35蛋白在牛优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于从属卵泡(P0.01)。4.基因沉默结果表明,沉默PRSS35基因会使卵泡颗粒细胞凋亡个数增多,卵泡液雌激素含量降低,说明PRSS35基因促进牛卵泡颗粒细胞的增殖,对牛卵泡生长发育起促进作用。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S823
【文章目录】：
摘要
第一章 文献综述
    1. 牛发情周期内卵泡的生长发育
        1.1 卵泡发育过程
        1.2 卵泡发育波
        1.3 卵泡的募集
        1.4 卵泡的选择与偏差
        1.5 卵泡的优势化
        1.6 卵泡的成熟与排卵
    2. 颗粒细胞对卵泡发育的影响
        2.1 卵泡颗粒细胞
        2.2 卵泡颗粒细胞与膜细胞协同作用
        2.3 颗粒细胞对卵母细胞的影响
        2.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响
    3. 丝氨酸蛋白酶35 （PRSS35）研究进展
        3.1 蛋白酶
        3.2 丝氨酸蛋白酶
        3.3 丝氨酸蛋白酶共同特征
        3.4 PRSS35的发现
        3.5 PRSS35的功能
    4. 本研究的目的和意义
第二章 PRSS35基因CDS序列克隆及生物信息学分析
    1 材料与方法
        1.1 试验动物及样品采集
            1.1.1 卵巢采集
            1.1.2 颗粒细胞分离
        1.2 试验仪器及试剂
            1.2.1 主要仪器
            1.2.2 主要试剂
            1.2.3 溶液的配置
        1.3 试验方法
            1.3.1 引物设计
            1.3.2 颗粒细胞Total RNA的提取
            1.3.3 Total RNA浓度及纯度检测
            1.3.4 反转录RT-PCR
            1.3.5 PCR扩增
            1.3.6 电泳检测
            1.3.7 PCR产物纯化
            1.3.8 牛PRSS35基因克隆测序
            1.3.9 PRSS35基因及蛋白序列生物信息学分析
    2 结果与分析
        2.1 牛卵泡颗粒细胞Total RNA
        2.2 牛PRSS35基因测序
        2.3 牛PRSS35蛋白的生物信息学分析
            2.3.1 牛PRSS35蛋白的理化性质预测
            2.3.2 牛PRSS35蛋白信号肽预测
            2.3.3 牛PRSS35蛋白糖基化位点以及磷酸化位点预测
            2.3.4 牛PRSS35蛋白功能结构域预测
            2.3.5 牛PRSS35序列相似性及聚类分析
    3 讨论
    4 小结
第三章 牛优势卵泡与从属卵泡的筛选
    1 材料与方法
        1.1 试验动物及样品采集
            1.1.1 卵巢采集
        1.2 试验仪器及试剂耗材
            1.2.1 试验仪器
            1.2.2 试验试剂及耗材
        1.3 试验方法
            1.3.1 采集卵泡液并分离颗粒细胞
            1.3.2 雌激素和孕酮的测定
                1.3.2.1 试剂的准备
                1.3.2.2 检测程序
                1.3.2.3 计算结果
    2 结果与分析
        2.1 卵泡液中雌激素和孕酮的测定
    3 讨论
    4 小结
第四章 PRSS35在牛卵泡颗粒细胞中的表达
    1 材料与方法
        1.1 试验动物及样品处理
            1.1.1 卵巢采集
            1.1.2 牛卵泡组织固定
            1.1.3 液氮研磨组织
        1.2 试验仪器及试剂耗材
            1.2.1 主要仪器
            1.2.2 试验试剂及耗材
            1.2.3 溶液的配置
        1.3 试验方法
            1.3.1 牛卵泡组织切片制作
            1.3.2 免疫组织化学
            1.3.3 颗粒细胞Total RNA的提取
            1.3.4 反转录RT-PCR
            1.3.5 PCR引物设计及扩增
            1.3.6 实时荧光定量PCR（qPCR）反应
            1.3.7 颗粒细胞Total Protein的提取
            1.3.8 Western Blot反应
            1.3.9 数据处理与分析
    2 结果与分析
        2.1 免疫组织化学结果
        2.2 荧光定量引物PCR结果
        2.3 实时荧光定量PCR（qPCR）扩增曲线与熔解曲线
        2.4 实时荧光定量PCR（qPCR）结果
        2.5 Western Blot结果
    3 讨论
    4 小结
第五章 PRSS35在牛卵泡颗粒细胞中的功能研究
    1 材料与方法
        1.1 试验动物
        1.2 试验仪器及试剂
            1.2.1 主要仪器
            1.2.2 主要试剂
            1.2.3 溶液的配置
        1.3 试验方法
            1.3.1 siRNA的设计与合成
            1.3.2 卵泡的分离
            1.3.3 卵泡颗粒细胞的分离
            1.3.4 卵泡颗粒细胞的培养
            1.3.5 卵泡颗粒细胞的传代与冻存
            1.3.6 siRNA转染卵泡颗粒细胞
            1.3.7 颗粒细胞Total RNA的提取
            1.3.8 反转录RT-PCR
            1.3.9 实时荧光定量PCR（qPCR）反应
2浓度测定 '>            1.3.10 siRNA转染颗粒细胞后培养液E₂浓度测定
            1.3.11 细胞凋亡检测
            1.3.12 数据处理与分析
    2 结果与分析
        2.1 细胞转染结果
        2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）结果
2浓度检测 '>        2.3 细胞培养液中雌二醇E₂浓度检测
        2.4 细胞凋亡检测结果
    3 讨论
    4 小结
全文结论
参考文献
Abstract
附录
致谢

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