干扰素诱导蛋白204抗金黄色葡萄球菌感染的作用及其机制

发布时间：2020-11-20 19:39

　　 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)既是共生菌组成成分,也是侵袭性感染的主要原因。尽管对金葡菌感染的致病机理及其与宿主的相互作用进行了大量研究,但宿主清除金葡菌的机制仍未完全阐明,阻碍了控制该病原感染新策略的发展。天然免疫系统在早期识别和清除入侵病原体中起着关键作用。天然免疫细胞通过模式识别受体(PRRs)感知病原,启动宿主防御机制。干扰素诱导蛋白204(IFI204,其人类同源蛋白为IFI16)是PRRs中的DNA传感器。有关IFI16/IFI204参与免疫反应的研究目前多集中于对病毒基因组的识别和抑制病毒复制方面,此外还有数篇关于其介导宿主细胞对几种胞内菌的识别和反应的相关研究报道,都是在体外基因敲降的基础上进行的。未见到有关IFI16/IFI204介导胞外菌识别的相关研究。尽管金葡菌也能在细胞内生长和传播,但通常被认为是细胞外致病菌。本课题应用IFI204基因缺失小鼠研究了IFI204在宿主防御金葡菌感染中的作用。在金葡菌呼吸道感染实验中,与WT(野生型)对照小鼠相比,IFI204~(-/-)(IFI204基因缺失型)小鼠的肺、支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液中的荷菌量更多,肺损伤更加严重。在金葡菌全身性感染实验中,IFI204~(-/-)小鼠的存活率显著低于WT小鼠,血液和肾脏中具有更高的荷菌量,肾损伤更加严重。此外,金葡菌呼吸道感染显著促进WT小鼠肺组织、BALF以及血液中细胞因子(IL-6,IL-1β、IFN-β)和趋化因子(KC/CXCL1?CXCL2?CXCL10)的表达,以及肺组织嗜中性粒细胞和巨噬细胞趋化。但感染后IFI204~(-/-)小鼠这些细胞因子/趋化因子的表达水平和肺内炎性细胞募集量都显著低于WT对照。这表明IFI204参与了宿主抗金葡菌感染的免疫防御,能抑制金葡菌增殖,减轻组织病理损伤,降低死亡率,并能在感染早期促进炎性细胞因子分泌和炎性细胞募集,在宿主防御金葡菌感染中发挥着不可或缺的保护作用。检测发现IFI204在金葡菌感染小鼠肺组织中主要表达于募集的炎性细胞,还发现巨噬细胞表达的IFI204主要定位于细胞核,且金葡菌能显著上调其表达,故以小鼠巨噬细胞作为体外研究的主要细胞。金葡菌明显诱导了WT巨噬细胞IFN-β和KC的表达,而感染后IFI204~(-/-)巨噬细胞IFN-β和KC的表达水平显著低于WT对照。IFI204对金葡菌基因组DNA诱导的IFN-β和KC表达具有相似的调节作用。这进一步证实了IFI204促进金葡菌诱导的炎性细胞因子分泌。针对其信号传递机制的研究中,结合体内和体外实验分析了在DNA触发的IFN-β诱导中起关键作用的STING-IRF3信号通路,以及在炎性反应、免疫应答等过程中起关键作用的NF-κB信号通路。在IFI204~(-/-)巨噬细胞中,金葡菌或其基因组DNA诱导的STING和IRF3活化水平显著低于WT巨噬细胞,并且NF-κB信号也受损。体内实验结果与此一致,证明IFI204促进了金葡菌诱导STING-IRF3和NF-κB炎性信号的活化。此外,实验发现重组细胞因子rKC和rIFN-β都不能抑制金葡菌呼吸道感染IFI204~(-/-)小鼠肺组织和血液中的细菌增殖,而用anti-IFNAR1单克隆中和抗体阻断I型IFN信号反而显著降低了金葡菌全身性感染IFI204~(-/-)小鼠的死亡率,表明IFI204在宿主防御金葡菌感染中的保护作用并不依赖于炎性细胞因子IFN-β和KC。为明确IFI204抗金葡菌感染免疫防御作用的机制,进而针对IFI204~(-/-)吞噬细胞对金葡菌的吞噬作用、胞内杀伤和胞外杀伤分别进行了实验,以探讨IFI204对吞噬细胞金葡菌清除能力的影响。金葡菌感染的IFI204~(-/-)巨噬细胞与WT巨噬细胞内吞的活金葡菌或热灭活金葡菌数量相等,庆大霉素处理后细胞内存活的金葡菌数量也相等,但IFI204~(-/-)巨噬细胞胞外活菌数量显著多于WT巨噬细胞。这表明IFI204并不影响巨噬细胞对金葡菌的内吞和胞内杀伤,但能促进其胞外杀菌活性。胞外诱捕网(ETs)是天然免疫防御中的一种胞外杀菌机制。与WT对照细胞相比,金葡菌感染后的IFI204~(-/-)巨噬细胞和嗜中性粒细胞的ETs形成显著减少,胞外杀菌能力下降。IFI204缺失也抑制PMA诱导的胞外DNA释放,表明IFI204能促进吞噬细胞ETs形成,提高其胞外杀菌能力。为进一步证实,对小鼠移植骨髓细胞后,再进行金葡菌呼吸道感染。与接受IFI204~(-/-)小鼠骨髓细胞的IFI204~(-/-)受体小鼠相比,接受WT小鼠骨髓细胞的IFI204~(-/-)受体小鼠感染后荷菌量较少、肺组织损伤较轻,炎性细胞募集增加、MPO活性增加,肺中的促炎细胞因子(KC、IL-1β、IL-6)也表现为相似变化趋势。这表明移植WT小鼠的骨髓细胞能够挽救IFI204~(-/-)小鼠由于金葡菌感染造成的肺损伤,恢复其炎性细胞募集能力和金葡菌清除能力,证实IFI204在宿主防御金葡菌感染中的保护作用依赖于骨髓来源的吞噬细胞等免疫细胞。综上所述,本课题证明了IFI204参与宿主抗金葡菌感染的免疫防御,能抑制金葡菌增殖和组织病理损伤,从而在金葡菌感染时对宿主起到保护作用,并能在感染早期促进炎性细胞因子分泌和炎性细胞募集。然而,IFI204的这一保护作用并不依赖于炎性细胞子IFN-β和KC,但依赖于骨髓来源的吞噬细胞等免疫细胞,且IFI204能促进金葡菌感染吞噬细胞ETs形成,从而增强吞噬细胞的胞外杀菌能力。这些发现揭示了IFI204在宿主防御胞外菌金葡菌感染中的重要作用和机制。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

吉林大学博士学位论文应 1 分钟，35 个循环；72℃反应 10 分钟，4℃降温。电泳跑胶，条带为 482 bp，IFI204-/-小鼠的目的条带为 582 bp。鉴定结果如物信息如下：因 引物序列 产04 WT上游 CTTCAGTCCACGTACCAAGAGC4下游 GCTAGAGCAAGATACCAACACTCG4 mutant上游 CTTCAGTCCACGTACCAAGAGC5下游 TCTGAGGCGGAAAGAACCAG

图 1.2 金葡菌呼吸道感染后 IFI204-/-小鼠荷菌量高于 WT 小鼠Figure 1.2 IFI204-/-mice had higher bacterial burden compare with WT mice afteStaphylococcus pulmonary infection.A.肺脏；B.支气管肺泡灌洗液；C.肾脏；D.肝脏；E.脾脏；F.血液；*p<0.05A.Lung；B.BALF；C.Kidney；D.Liver；E.Spleen；F.Blood；*stands for p<0.0病理学检测实验中，肉眼观察小鼠肺脏病变情况，发现金葡菌呼吸道感染肺脏都可见深红色的病变区，但 IFI204-/-小鼠肺组织眼观病变与 WT 对照小比更严重（图 1.3）。金葡菌呼吸道感染肺组织切片 H&E 染色观察，发现未小鼠支气管腔、肺泡腔内没有炎性细胞浸润，肺泡结构完整；金葡菌感染 W鼠肺组织出现炎性细胞浸润和红细胞渗出，肺泡减少，肺泡间隔毛细血管充血葡菌感染 IFI204-/-小鼠的肺组织损伤更为严重，可见肺组织严重充血，甚至实变，肺泡萎缩、消失或融合成肺大泡（图 1.4）。这提示 IFI204 对金葡菌呼

图 1.3 金葡菌呼吸道感染 IFI204-/-小鼠肺组织眼观病变与 WT 小鼠相比更严重Figure 1.3 The pathological changes in lung tissues of IFI204-/-mice were moresevere compare with WT mice after Staphylococcus pulmonary infection.图 1.4 金葡菌呼吸道感染 IFI204-/-小鼠肺病理学损伤与 WT 小鼠相比更严重
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本文编号：2891898