蛋氨酸对猪血管内皮细胞血管生成及其关键基因表达的调控

发布时间：2020-11-21 19:14

　　 在哺乳动物妊娠期,胎盘是调节宫内环境和保障胎儿发育的重要媒介,其中胎盘的血管网发挥了关键作用。有研究发现提高妊娠期日粮中蛋氨酸水平能够提高仔猪初生窝重和仔猪初生个体重,然而蛋氨酸调控胎盘血管发育的作用及其调控机理尚不清楚。本研究以猪血管内皮细胞为研究对象,构建了猪胎盘滋养层细胞与血管内皮细胞共培养模型,研究了蛋氨酸对猪血管内皮细胞血管生成的调控规律;并进一步从关键基因表达调控角度,研究蛋氨酸调控内皮细胞血管生成关键基因的关键机制。主要研究内容和结果如下:1.提高蛋氨酸水平对猪血管内皮细胞血管生成的影响。通过建立猪血管内皮细胞与猪滋养层细胞体外共培养模型,研究在猪血管内皮细胞单独培养和与猪胎盘滋养层细胞共培养条件下,将蛋氨酸从生理浓度(0.05mmol/L)提高到0.2和0.5 mmol/L对猪血管内皮细胞血管生成的影响。结果显示,在单独培养或者共培养条件下,提高蛋氨酸的水平都显著促进了内皮细胞的成管(P0.05),但是蛋氨酸与培养条件不存在交互作用,说明了蛋氨酸促进内皮细胞血管生成不依赖于滋养层细胞。2.提高蛋氨酸水平影响猪血管内皮细胞血管生成的主要事件。提高蛋氨酸水平后内皮细胞形成管腔数、总的分支长度和总的节点数显著增加(P0.05)。通过MTT法和流式细胞术,检测不同浓度蛋氨酸处理对细胞增殖的影响,结果表明,随着蛋氨酸浓度的增加,细胞活力显著增加(P0.05),但是对细胞周期没有影响。细胞划痕和Transwell小室迁移法检测提高蛋氨酸水平对细胞迁移能力的影响,结果发现随着蛋氨酸浓度增加,细胞的迁移能力显著增加(P0.05),说明了提高蛋氨酸水平主要影响了内皮细胞血管生成中的细胞迁移事件。3.蛋氨酸对内皮细胞血管生成关键基因的调控。对细胞迁移基因和血管生成相关基因mRNA表达变化检测发现,增加蛋氨酸水平(0.05mmol/L Vs0.5mmol/L)对MMP2的mRNA表达没有影响,但是显著增加了MMP9、VEGF-A、VEGF120、VEGF164、VEGFR-1的mRNA水平(P0.05),血管生成负调节基因sVEGFR-1的表达量也显著增加(P0.05)。在0.5mmol/L蛋氨酸处理条件下,检测蛋氨酸不同处理时间对猪血管内皮细胞细胞VEGF-A的mRNA表达的变化,结果表明随着蛋氨酸处理时间的增加,VEGF-A的mRNA表达水平逐渐增加,当处理时间达到24h时,显著促进了VEGF-A mRNA的表达(P0.05)。此外,蛋氨酸不同处理时间或不同浓度蛋氨酸对猪胎盘滋养层细胞VEGF-A的mRNA表达没有影响。4.VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。本试验利用VEGF-A抑制剂Bevacizumab对细胞进行处理,研究了VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。结果表明,与高浓度蛋氨酸处理组相比,添加Bevacizumab处理后的细胞迁移能力显著降低(P0.05),而与生理浓度蛋氨酸相比没有显著性差异。在血管生成试验中,添加Bevacizumab处理后形成管腔数、总的分支长度和总的节点数与高浓度蛋氨酸处理组相比显著降低(P0.05);与生理浓度蛋氨酸相比,总的分支长度仍显著增加(P0.05),总的节点数无显著差异。说明了在猪血管内皮细胞中,VEGF-A在介导蛋氨酸促进内皮细胞的血管生成中发挥了关键作用。5.蛋氨酸调控VEGF-A基因表达机制的研究。VEGF-A的mRNA水平增加涉及到转录水平和转录后水平的调控。本试验通过染色质免疫共沉淀技术来探究蛋氨酸对RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因CDS区的结合能力的影响。结果表明,在高蛋氨酸水平下,RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因启动子结合没有显著变化。利用放线菌素D进行处理,当处理时间增加到30和60min时,高蛋氨酸处理组VEGF-A的mRNA稳定性显著高于低蛋氨酸处理组(P0.05)。说明了,提高蛋氨酸不影响VEGF-A转录水平,而是通过提高VEGF-A mRNA转录后的稳定性来调节的。综上所述,本研究的结论是:1.提高蛋氨酸水平促进了猪血管内皮细胞的迁移和血管生成,但该作用不依赖于滋养层细胞。2.蛋氨酸促进猪血管内皮细胞迁移和血管生成是通过提高VEGF-A基因表达来实现的。3.蛋氨酸通过影响了VEGF-A mRNA转录后的稳定性提高了VEGF-A的mRNA水平。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S828.5
【部分图文】：

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文绒毛膜胎盘、上皮绒毛膜胎盘、内皮绒毛膜胎盘和结缔绒毛膜胎ding and Burton 2008）。母猪妊娠期形成的上皮绒毛膜胎盘，胎儿与母体营养物质的交换需要经过六层组织层数，包括胎儿面的胎盘血管内皮细盘基质结缔组织层、胎盘绒毛上皮层，母体面的母体子宫内膜上皮层、结缔组织层、母体血管内皮细胞层（Renfree et al 1982；杨倩等 2008）（。在猪整个妊娠期，胎盘绒毛膜外侧的滋养层上皮细胞都未嵌入子宫内(Corner et al 1921；Anderson et al 1976)，所有的绒毛膜与子宫粘膜紧密有侵入，也没有破坏子宫粘膜，最终形成了弥散型上皮绒毛膜胎盘(Co21；Burton et al 2008；Cristofolinni et al 2017)。

图 1-2 母猪胎盘的胎儿和母体血管（引自 Leiser et al 1988）（MA，母体动脉；MAI，母体微动脉；FA，胎儿动脉；FAI，胎儿微动脉；FV，胎儿脉；FVI，胎儿微静脉）Fig 1-2 Maternal and fetal vessel cast of pig placenta（Leiser et al 1988）（MA, maternal artery; Mal, maternal arteriole; FA, fetal artery; FAI, fetal arteriole; FV, fetal veFVl, fetal venule）2.2 猪胎盘发育规律对大多数家畜物种来说，在胚胎发育过程中，从受精卵到囊胚的大多数阶是相似的（King et al 1993；Roberts et al 2008）。随后，由于母体与胎儿之间相作用方式的不同，将一个物种与另一个物种区分开来（Hyttle et al 1990；Ramial 2016）。与其他物种不同的是，猪妊娠期所形成的胎盘屏障更薄，扩散距离更

用于维持胎儿生长需要。血管生成形成的成熟血管网络主要是通过两种血管生长方式来完成的（如图1-4）：（1）在原有血管基础上以非分枝的方式生长，包括血管伸长和嵌入。这种方式通过在血管的末端进行纵向生长，使毛细血管增长，并增加血管的连接点和分支之间的距离来增加毛细血管袢（Demir et al 2007）。（2）以分枝的方式进行血管生长，包括出芽和血管套叠。这种血管生长能够增加血管分枝以及形成网状结构。出芽是血管生成中极为重要的生长方式，包括血管的内皮细胞降解基底膜，增殖并迁移到周围的结缔组织中，内皮细胞形成管状结构，这种血管生成的方式能够形成多个毛细血管。血管套叠能够在原有血管腔内陷形成管腔内的组织柱样结构，进而形成新的毛细血管。这个过程使一个血管分枝形成两个，最终形成并行的毛细血管（Kaufmann et al 2004；Charnock et al 2004）。与此同时，内皮生长出来的新血管稳定发育成动脉或静脉过程中，会募集血管周细胞和平滑肌细胞来共同维持血管的稳定。（Mayhew et al 2004；Kay et al 2011；Wang et al 2017）。图 1-4：血管生成模式图（修改自 Juan et al 2008；Kay et al 2011 ）Fig.1-4 Modes of angiogenesis (Modified from Juan et al 2008; Kay et al 2011)
【参考文献】

相关期刊论文 前7条

1 彭璇;张居作;薛立群;;猪胎盘显微结构研究进展[J];湖南畜牧兽医;2015年05期

2 冯晓友;雷东风;彭峰;彭小利;黄毅;;蛋氨酸在猪营养中的应用研究进展[J];猪业科学;2011年06期

3 周怡伶;黄德贵;杨波;;蛋氨酸负荷后大鼠主动脉血管内皮细胞早期形态扫描电镜观察[J];广东微量元素科学;2011年05期

4 任晓丽;杨波;黄陈平;陈锡文;;高蛋氨酸饮食对大鼠血管内皮细胞分泌功能的影响[J];氨基酸和生物资源;2010年04期

5 宗凯;刘国庆;曹树青;钱晓勇;张黎利;汪洋;;日粮蛋氨酸和赖氨酸水平对肉鸡生长性能及肌肉和肝脏组织DNA甲基化含量的影响[J];粮食与饲料工业;2010年02期

6 乔德堂;;动物的蛋氨酸营养研究进展[J];山东畜牧兽医;2007年04期

7 马雪兴,刘王明,吾柏铭;叶酸、维生素B_6 、维生素B_(12) 对兔高蛋氨酸引致高同型半胱氨酸水平及动脉硬化的影响[J];高血压杂志;2002年01期

相关博士学位论文 前1条

1 郭棚;精氨酸对初产母猪繁殖性能及胎盘滋养层细胞增殖的影响[D];东北农业大学;2017年

相关硕士学位论文 前1条

1 韩超;蛋氨酸负载对大鼠肝细胞同型半胱氨酸代谢的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年

本文编号：2893468