猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序与病毒遗传变异分析

发布时间：2020-11-21 19:18

　　 猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种猪传染病,其临床症状主要为妊娠母猪发生流产和仔猪出现神经症状,给养猪业造成了巨大损失。自上世纪90年代我国猪群通过免疫疫苗而有效控制该病,但自2011年下半年以来,在我国黑龙江、吉林、河南、江苏等多个省份的免疫Bartha-K61疫苗的猪场相继爆发了PR。2012年,本实验室于河南某免疫Bartha-K61疫苗猪场分离出一株PRV,命名为HeN1株,并证明疫苗Bartha-K61不能对HeN1感染提供完全的保护。此后,国内多个实验室也相继分离到了类似毒株。然而目前,对我国PRV当前流行毒株的分子特征、遗传变异情况尚不清楚。本研究对PRV HeN1株进行了全基因组测序和注释。同时将HeN1序列与仅有的5条PRV完整基因组序列和1条90%以上完整序列进行了全基因组水平上的比较分析。分析结果表明,与国外毒株相比HeN1有多处插入、缺失。同时本研究设计了多对覆盖插入、缺失区域的引物,验证了多株国内不同时期和省份的PRV分离株也存在这些缺失、插入。国内毒株的这种缺失、插入特征提示我国流行的PRV与国外毒株之间存在着明显的差异。本研究进而对PRV又进行了系统分型研究。国外学者利用两种不同分型方法对PRV进行过较详细分型研究,然而我国毒株尚未有分型的报道。本研究利用限制性片段多态性(RFLP)分型方法和gC遗传进化分类方法对PRV进行了分型研究。首次指出,我国流行的PRV与国外PRV毒株分别属于两个不同的基因亚型:国外毒株主要属于基因Ⅰ型,中国毒株主要属于基因Ⅱ型。HeN1和Bartha-K61的血清对这两株病毒的交叉中和实验结果也表明这两株病毒间存在一定的抗原性差异。感染和毒力相关基因的遗传变异表明我国PRV流行株的感染和毒力相关基因具有相似的分子特征,与我国早期PRV相应基因同源性较高。相比之下,国外毒株与国内毒株间各相关基因有较大突变和缺失、插入,二者进化关系较远。简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)是用来分析疱疹病毒遗传变异的重要分子特征。本研究对PRV全基因组序列的SSR进行了全面的分析和比较。结果表明SSR在3株中国毒株和3株国外毒株间存在很大差异,而在各基因型内部差别较小。SSR广泛参与了PRV基因组的变异,并导致两基因型间很多特征插入缺失区域的产生。我们还比较了单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和PRV这两种病毒的同源蛋白在毒株间的变异性,我们发现PRV编码蛋白在株间变异性比HSV-1编码的相应蛋白的变异性高很多,这在α疱疹病毒中是很少见的。本研究在全基因组水平上对我国流行PRV的遗传变异情况进行分析,据此将PRV分为两个基因型:Ⅰ型主要为国外毒株,Ⅱ型主要为国内毒株。这也是Bartha-K61疫苗(Ⅰ型)对国内当前流行株(Ⅱ型)不能完全保护的重要原因。本研究促进了对我国PRV的分子特征、遗传背景的认识,同时也为PRV防控的策略制定、新疫苗的开发提供了重要的科学依据。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 猪伪狂犬病的发生、发展历史
    1.2 猪伪狂犬病病毒的生物学特征
        1.2.1 猪伪狂犬病病毒的分子生物学特性
        1.2.2 猪伪狂犬病病毒的培养特性
        1.2.3 猪伪狂犬病病毒的感染特性
        1.2.4 猪伪狂犬病病毒的临床症状和病理变化
    1.3 猪伪狂犬病病毒的血清和基因分型
    1.4 诊断和疫苗研究
    1.5 研究目的及意义
第二章 PRV HeN1株全基因组测序和注释及其插入缺失特征的验证
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒和细胞
        2.1.2 菌株、试剂与载体
        2.1.3 主要设备仪器
        2.1.4 病毒基因组DNA的提取及纯化
        2.1.5 引物设计
        2.1.6 病毒基因组分段PCR扩增
        2.1.7 感受态细胞的制备
        2.1.8 PCR产物的回收、克隆和测序
        2.1.9 测序结果拼接和基因组注释
        2.1.10在中国其他毒株上验证He N1特异插入缺失区域
    2.2 结果
        2.2.1 病毒基因组DNA琼脂糖凝胶电泳
        2.2.2 基因组序列分段PCR扩增结果
        2.2.3 PRV HeN1全基因组序列的获得
        2.2.4 PRV HeN1基因注释
        2.2.5 在中国其他毒株上验证He N1特异插入缺失区域
    2.3 讨论
第三章 以HeN1为代表的中国PRV毒株与国外毒株的比较基因组分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 毒株序列
        3.1.2 中国毒株与国外毒株全基因组水平差异比较
        3.1.3 HeN1株和欧美毒株的蛋白编码序列比较分析
        3.1.4 HeN1与Kaplan、Becker、Bartha、JS、TJ和BJ/YT差异氨基酸的比较分析
        3.1.5 中国毒株与国外参考毒株之间微卫星序列（SSR）的比较分析
        3.1.6 PRV和HSV-1 编码蛋白的变异性比较
        3.1.7 限制性片段长度多态性分析（RFLP）
        3.1.8 PRV遗传进化分析
        3.1.9 PRV Bartha和HeN1株间的交叉中和实验
    3.2 结果
        3.2.1 中国毒株与国外毒株全基因组水平差异比较
        3.2.2 国内外PRV毒株相应的各蛋白编码序列间有显著的氨基酸变异
        3.2.3 SSR在中国毒株与国外参考毒株之间的比较分析
        3.2.4 PRV和HSV-1 所编码的蛋白在毒株间的变异性比较
        3.2.5 PRV的基因分型
        3.2.6 伪狂犬病病毒的进化速率
        3.2.7 Bartha和HeN1免疫猪产生的抗血清对这两株病毒的交叉保护力研究
    3.3 讨论
第四章 猪伪狂犬病病毒HeN1株感染和毒力相关基因的变异特征分析
    4.1 材料和方法
        4.1.1 序列信息
        4.1.2 PRV感染和毒力相关基因的比对分析
        4.1.3 PRV序列的进化树分析
    4.2 结果
        4.2.1 HeN1与国内外参考株的各相关基因核苷酸同源性比较
        4.2.2 PRV感染和毒力相关蛋白的变异特征
        4.2.3 PRV各基因进化树分析
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
附录
    附录表S1分段扩增HeN1全基因组的引物
    附录表S2 HeN1株与国内外毒株Kaplan、Bartha、Becker、BJ/YT、TJ和JS蛋白编码差异比较表
    附录表S3国外毒株Kaplan、Bartha和Becker与HeN1相比各蛋白变异氨基酸数量表
    附录表S4 PRV和HSV-1 基于贝叶斯算法估算得到替换率和各自毒株间最近分化时间
    附录图S1所有PRV毒株基于66个基因构建的的进化树
致谢
作者简历

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 孙瑞;赵恒章;马金友;李培庆;余燕;;猪伪狂犬病的组织病理学观察[J];贵州农业科学;2009年03期

本文编号：2893474