基于纳米抗体-HRP融合蛋白鸡血清中抗NDV抗体竞争ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-12-04 20:36

　　新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染引起的禽类传染病,是一类动物疫病,严重危害养禽业的健康发展。核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）作为NDV的主要结构蛋白,是抗NDV抗体检测方法建立的主要靶抗原。纳米抗体相比于传统抗体具有分子量小,易于基因工程改造的优点。为了建立NDV新型诊断技术,本研究基于纳米抗体的优点,将其应用于NDV新型诊断技术的研发中。本研究首先利用原核表达系统表达NDV的NP蛋白,将NDV-NP可溶性重组蛋白免疫双峰驼,然后利用噬菌体展示技术,通过3轮淘选,共筛到9株针对NP蛋白的特异性纳米抗体。随后,基于针对NDV-NP蛋白的纳米抗体,建立了纳米抗体—辣根过氧化物酶（HRP）融合蛋白制备平台,然后将该融合蛋白用于开发鸡血清中抗NDV抗体的竞争性ELISA（cELISA）检测方法。1、NDV-NP重组蛋白的表达与纯化构建重组NDV-NP重组表达载体,Western blot和SDS-PAGE分析在56 kDa有预期大小的重组蛋白NDV-NP蛋白。2、抗NDV-... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 新城疫及纳米抗体的研究概况
        1.1 新城疫的研究进展
            1.1.1 新城疫概述
            1.1.2 新城疫病毒特点
            1.1.3 NDV编码的主要蛋白特点
            1.1.4 NDV的传播方式及感染途径
            1.1.5 新城疫的诊断
            1.1.6 新城疫疫苗
        1.2 纳米抗体研究进展
            1.2.1 纳米抗体概述及特点
            1.2.2 纳米抗体的主要应用
        1.3 研究目的及意义
试验研究
    第二章 NDV-NP重组蛋白的表达与纯化
        2.1 试验材料与仪器设备
            2.1.1 载体和菌株
            2.1.2 主要试剂耗材
        2.2 试验方法
            2.2.1 NDV-NP基因扩增
            2.2.2 NP蛋白的表达及纯化
        2.3 试验结果
            2.3.1 原核表达载体PET-28A-NDV-N构建
            2.3.2 HIS-NP重组蛋白的诱导表达和与纯化
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 抗NDV-NP蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选
        3.1 试验材料
            3.1.1 质粒、菌株与实验动物
            3.1.2 主要试剂与材料
        3.2 试验方法
            3.2.1 免疫双峰驼
            3.2.2 纳米抗体抗体文库的构建
            3.2.3 抗NP蛋白特异性纳米抗体的淘选
        3.3 试验结果
            3.3.1 抗NP蛋白抗体滴度测定
            3.3.2 纳米抗体文库的构建
            3.3.3 筛选过程重组噬菌体的富集情况
            3.3.4 抗NP蛋白特异性纳米抗体的ELISA鉴定
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 基于纳米抗体-HRP融合蛋白鸡血清中抗NDV抗体竞争ELISA检测方法的建立
        4.1 试验材料
            4.1.1 质粒,菌株和细胞系
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 主要仪器设备
        4.2 试验方法
            4.2.1 构建PEGFP-N1-NDV-NP-NB5 真核载体
            4.2.2 真核表达NDV-NP-NB5 蛋白
            4.2.3 验证NP蛋白与NDV-NP-NB5 的亲和力
            4.2.4 确定NP与 NDV-NP-NB5 的最佳稀释浓度
            4.2.5 确定竞争ELISA方法的血清稀释度和孵育时间
            4.2.6 竞争ELISA方法检测SPF鸡血清确定CUT-OFF值
            4.2.7 建立竞争ELISA方法检测临床鸡血清
        4.3 试验结果
            4.3.1 PEGFP-NDV-NP-NB5 真核表达载体的构建
            4.3.2 NDV-NP-NB5 的表达以及与NDV-NP蛋白亲和力的鉴定
            4.3.3 确定竞争ELISA的条件
            4.3.4 竞争ELISA方法检测临床鸡血清
        4.4 讨论
        4.5 小结
结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：2898206