2株H5N6亚型禽流感病毒的序列分析和致病性研究

发布时间：2017-04-07 18:16

  本文关键词：2株H5N6亚型禽流感病毒的序列分析和致病性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自2014年5月四川省第一次报道人感染H5N6亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)以来,云南和广东省相继报道H5N6高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI)感染人的事件。由于广东省和四川省两省间隔距离较远,家禽和人感染H5N6的来源、致病性以及传播引起了公众的高度关注。在2014-2015年期间,本研究室在广东省内野鸟的流行病学监测过程中,从鹊鸲和毛腿沙鸡上分离到2株新型的H5N6病毒,分别命名为A/Pallas's Sandgrouse/Guangdong/ZH283/2015和A/Oriental Magpie-robin/Guangdong/SW8/2014。基因和进化树表明,2株AIV由多个不同来源的毒株的基因片段重组而成。HA基因属于H5N1亚型,进化分支属2.3.4.4,NA基因则与欧亚家禽源的H6N6亚型相同,位于ST192-like分支;ZH283与感染人的H5N6病毒(A/Guangdong/ZQ874/2015)高度同源,SW8与另外分离的感染人的H5N6病毒(A/Guangzhou/39715/2014)高度同源,表明感染人的H5N6可能来源于野鸟毒株的片段重组。对全基因序列测定后发现,2株毒株的HA的裂解位点均是-RRRKR↓G-,含有4个碱性氨基酸,裂解位点符合高致病性禽流感病毒典型分子特征,且ZH283的HA蛋白的I155T受体结合位点突变为T,分子特性表明ZH283对人源受体有一定的亲和关系。2个毒株的PB2蛋白在E627K和D701N这两个位点都没有突变,NP蛋白A184K突变,NS1蛋白的D92E也均发生了突变。为了研究这2株H5N6亚型AIV的生物学特性,本文对这2株毒住进行了SPF鸡、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鸭和鹌鹑的致病性试验。SPF鸡的致病性试验结果显示,2株H5N6对SPF鸡高度致死并引起组织器官感染,在肺脏、气管和法氏囊等10个脏器中均能检测到较高的病毒滴度,ZH283组被检的10个脏器中的病毒滴度都达到7.83log_(10)EID_(50)/g以上,肺的滴度较高,达10.08 log_(10)EID_(50)/g;在SW8组被检的10个脏器中,log_(10)EID_(50)/g值在5.58~7.58范围内,较高是法氏囊和胰腺,较低是心脏;感染组和同居组的SPF鸡均可经咽喉和泄殖腔排毒。BABL/C小鼠的致病性试验结果显示,2株毒株对小鼠都具有高致病性与高致死率,致死率均为100%;感染病毒后的小鼠体重均有下降,ZH283组下降率达到23%,SW8组下降率为12.7%;ZH283和SW8在小鼠体内复制的病毒滴度也较高,特别是肺脏,第5 d分别高达10.00 log_(10)EID_(50)/g和9.5 log_(10)EID_(50)/g。豚鼠的致病性试验结果显示,2株病毒感染豚鼠后在鼻甲骨、气管和肺脏等8个组织脏器中均能检测到病毒的复制,log_(10)EID_(50)/g值在3.75~6.42范围内,其中鼻甲骨中复制能力较强,ZH283组和SW8组分别为6.42 log_(10)EID_(50)/g和6.33 log_(10)EID_(50)/g,肺脏次之,ZH283组和SW8组分别为5.75 log_(10)EID_(50)/g和6.25 log_(10)EID_(50)/g。同时也能在豚鼠的鼻腔和泄殖腔中分离到病毒,同居组也均能在鼻腔和泄殖腔中分离到病毒。北京鸭的致病性试验结果显示,在气管、肺脏和肾等10个脏器中均能检测到病毒的复制,感染组和同居组的鸭均可经咽喉和泄殖腔向外排毒,检测出同居组的鹌鹑向外排毒的病毒滴度比感染组和同居组的鸭子高;另一方面2个同居组的鹌鹑出现了较高的死亡率,ZH283鹌鹑同居组的死亡率为2/3,SW8鹌鹑同居组的死亡率为1/3。鹌鹑的致病性试验结果显示,感染组的鹌鹑致死率为100%,ZH283与SW8同居组的鹌鹑死亡率分别为2/3和1/3,同居组的鸭子则有较高的存活率,ZH283组与SW8组分别为2/3和3/3;在感染组的鹌鹑的盲肠扁桃体、肺脏和肾等9个组织脏器均能检测到较高滴度病毒的复制,log_(10)EID_(50)/g值在7.25~9.5范围内;感染组和同居组均能在口腔和泄殖腔拭子中分离到病毒。综上所述,2株H5N6亚型AIV对SPF鸡、BABL/C小鼠、豚鼠、北京鸭和鹌鹑表现出不同的致病性,当中以对SPF鸡和BABL/C小鼠的致病性较强,鹌鹑和豚鼠次之,对北京鸭不表现致病性。2株H5N6亚型AIV能经感染的北京鸭传播到鹌鹑,也能从感染的鹌鹑传播到北京鸭。本文中重组的H5N6亚型AIV从广东省内的野鸟分离而得,提示野鸟能够感染、携带H5N6,并且随其迁徙将H5N6传播至其他地方,进而感染更多的野鸟和哺乳动物,对公共卫生安全构成了潜在的威胁,值得高度关注。
【关键词】：高致病性禽流感 H5N6 基因序列 致病性 传播
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 常用英文缩略表8-13
• 1 前言13-16
• 1.1 禽流感概述13
• 1.2 禽流感病毒病原学特点13-14
• 1.3 H5N6亚型禽流感14-15
• 1.3.1 H5亚型AIV的流行状况与遗传变异14
• 1.3.2 H5N6亚型AIV及抗原变异14-15
• 1.3.3 H5N6亚型AIV的公共卫生学意义15
• 1.4 本研究的目的与意义15-16
• 2 材料16-18
• 2.1 病料和毒株背景16
• 2.2 鸡胚、试验动物和菌种16
• 2.3 主要仪器设备16
• 2.4 主要试剂和分子生物学材料16-17
• 2.5 分子生物学软件17-18
• 3 方法18-27
• 3.1 H5N6病毒的分离18
• 3.2 H5N6亚型AIV HA、NA基因的分子生物学鉴定18-20
• 3.2.1 引物设计18
• 3.2.2 H5N6亚型AIV的RNA提取18-19
• 3.2.3 H5N6亚型AIV的c DNA合成19-20
• 3.3 H5N6亚型AIV的有限稀释法纯化20
• 3.4 鸡胚半数感染量（EID50）的测定20
• 3.5 H5N6亚型AIV的全基因序列扩增20-24
• 3.5.1 引物设计20-21
• 3.5.2 H5N6亚型AIV的RNA提取21
• 3.5.3 H5N6亚型AIV的c DNA合成21
• 3.5.4 H5N6亚型AIV全基因的PCR扩增21-22
• 3.5.5 目的片段的检测22
• 3.5.6 PCR扩增结果的回收及纯化22
• 3.5.7 目的片段与PGEM-T载体的连接与转化22-23
• 3.5.8 筛选与鉴定阳性菌落23
• 3.5.9 各目的片段序列的测定与拼接23-24
• 3.6 2 株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验24-25
• 3.6.1 2 株H5N6亚型的AIV在SPF鸡体内复制情况24
• 3.6.2 2 株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后排毒情况24-25
• 3.7 2 株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠的致病性试验25
• 3.7.1 2 株H5N6亚型的AIV在小鼠体内复制情况25
• 3.8 2 株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性试验25-26
• 3.8.1 2 株H5N6亚型的AIV在豚鼠体内复制情况26
• 3.8.2 2 株H5N6亚型AIV感染豚鼠后排毒情况26
• 3.9 2 株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验26-27
• 3.9.1 2 株H5N6亚型的AIV在北京鸭体内复制情况26
• 3.9.2 2 株H5N6亚型AIV感染北京鸭和鹌鹑后的排毒情况26-27
• 3.10 2 株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性与跨种传播试验27
• 3.10.1 2 株H5N6亚型的AIV在鹌鹑体内复制情况27
• 3.10.2 2 株H5N6亚型AIV感染北京鸭后排毒情况27
• 4 结果与分析27-54
• 4.1 毒株的初步分离鉴定结果27-28
• 4.2 毒株的HA、NA基因的分子生物学鉴定结果28
• 4.3 H5N6亚型AIV纯化的结果28
• 4.4 鸡胚半数感染量（EID50）测定结果28
• 4.5 H5N6亚型AIV的全基因序列及分析结果28-41
• 4.5.1 HA基因序列分析28-29
• 4.5.2 NA基因序列分析29-30
• 4.5.3 PB2基因序列分析30-34
• 4.5.4 PB1基因序列分析34
• 4.5.5 PA基因序列分析34-40
• 4.5.6 NP基因序列分析40
• 4.5.7 M基因序列分析40-41
• 4.5.8 NS基因序列分析41
• 4.6 2 株H5N6亚型AIV对SPF鸡的致病性试验结果41-42
• 4.6.1 2 株H5N6亚型AIV感染SPF鸡后的存活情况41
• 4.6.2 2 株H5N6亚型AIV在SPF鸡体内的复制情况41-42
• 4.6.3 SPF鸡感染后口咽和泄殖腔的排毒情况42
• 4.6.4 14 d后存活的SPF鸡血清抗体测定结果42
• 4.7 2 株H5N6亚型AIV对BABL/C小鼠的致病性试验结果42-44
• 4.7.1 2 株H5N6亚型AIV感染SPF BALB/C小鼠后的存活情况42-43
• 4.7.2 2 株H5N6亚型AIV感染SPF BALB/C小鼠后体重变化情况43-44
• 4.7.3 2 株H5N6亚型AIV在SPF BALB/C小鼠体内复制情况44
• 4.8 2 株H5N6亚型AIV对豚鼠的致病性试验结果44-46
• 4.8.1 2 株H5N6亚型AIV感染豚鼠后的存活情况44-45
• 4.8.2 2 株H5N6亚型AIV在豚鼠体内的复制情况45
• 4.8.3 豚鼠感染后鼻腔和泄殖腔的排毒情况45-46
• 4.8.4 14 d后存活的豚鼠血清抗体测定结果46
• 4.9 2 株H5N6亚型AIV对北京鸭的致病性与跨种传播试验结果46-47
• 4.9.1 2 株H5N6亚型AIV感染北京鸭后的存活情况46
• 4.9.2 2 株H5N6亚型AIV在北京鸭体内的复制情况46-47
• 4.9.3 北京鸭感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情况47
• 4.9.4 14 d后存活的北京鸭和鹌鹑的血清抗体测定结果47
• 4.10 2 株H5N6亚型AIV对鹌鹑的致病性与跨种传播试验结果47-54
• 4.10.1 2 株H5N6亚型AIV感染鹌鹑后的存活情况47-48
• 4.10.2 2 株H5N6亚型AIV在鹌鹑体内的复制情况48
• 4.10.3 鹌鹑感染病毒后口咽拭子和泄殖腔拭子的排毒情况48-49
• 4.10.4 14 d后存活的鹌鹑和北京鸭的血清抗体测定结果49-54
• 5 讨论54-58
• 全文总结58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-64
• 附录：攻读硕士学位期间的科研成果64

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本文编号：291046