柔嫩艾美耳球虫耐药相关基因特性初步研究及耐药株与敏感株全基因组重测序分析
发布时间：2020-12-13 20:09
柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是一种寄生于鸡盲肠的单细胞寄生原虫,是鸡球虫病的主要病原体,目前国内外对鸡球虫病的防治主要依靠药物。长期使用药物使其对药物表现出严重的抗性,给禽类的养殖带来了大量的经济损失。为研究鸡球虫耐药性产生的机制,本实验室前期以柔嫩艾美耳球虫的药物敏感株（DS）为亲本,诱导出抗地克珠利耐药株（DZR）和抗马杜拉霉素耐药株（MRR）。对2个耐药株和敏感株进行转录组测序,筛选了敏感株与耐药株的差异表达基因。在此基础上,本研究选择4个在耐药株体内显著上调的基因,分别为柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（HD domain-containing protein,EtHDCP）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,EtGAPDH）、伴侣蛋白TCP-1环状复合物亚基α（T-complex protein 1 subunitα,EtTCP-1α）和苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase,EtMDH）。对这4个基因进行特性和功能的初步分析,并用全基因组重测序的方法对敏感株和2个耐药株进行测...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纯化的柔嫩艾美耳球虫4个阶段虫体Fig.2.1Purified4developmentalstagesofEimeriatenellaA：孢子化卵囊（×200）；B：未孢子化卵囊（×200）；C：子孢子（×200）；D：裂殖子（×400）
经凝胶电泳分析其完整性（图2.2），可见提取的总 RNA 具有典型的 3 个条带，表明提取的 RNA 未被降解，完整性较好。分光光度计检测结果 OD260/OD280=1.93，表明 RNA 未被蛋白质和 DNA 污染，可进行下一步的反转录，用反转录 M-MLV 试剂盒，得到柔嫩美耳球虫孢子化卵囊的 cDNA 第一链，保存于-20℃。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 4 个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析因的 cDNA 片段。2.3.3.4 EtMDH 基因的 ORF 克隆根据 EtMDH 基因 ORF 序列，设计特异性引物，以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊 cDNA 为模板，设定合适的退火温度进行 PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，可以发现在 954 bp处有特异性的单一条带（图 2.3D），与预期条带位置相符；将条带位置正确的 PCR 产物切下，用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行回收。纯化后的 PCR 产物与 pGEM-T-easy 载体 4℃条件下连接 8h 后，将连接产物转入大肠杆菌 TOP10 感受态细胞中，在 LB 固体平板中挑取阳性菌落进行培养，并用 PCR 对菌液进行鉴定和测序。测序结果与原序列比对正确，表明成功扩增获得 EtMDH 基因的 cDNA 片段。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗精噁唑禾草灵和甲基二磺隆看麦娘ACCase和ALS基因突变[J]. 赵宁,郭文磊,李伟,吕玲玲,刘伟堂,王金信. 植物保护学报. 2017(05)
[2]四个半LIM结构域蛋白1对人肝癌细胞紫杉醇耐药影响的研究[J]. 周蕾,姜妮,周心娜,王小利,任军. 中国临床药理学杂志. 2017(12)
[3]小檗碱对禽源大肠杆菌抑菌作用及耐药消除作用的转录组学分析[J]. 张石磊,翟向和,王春光,陈谏,贾泽,张铁. 中国畜牧兽医. 2017(05)
[4]恶性疟原虫与耐药性相关分子遗传标记的研究进展[J]. 徐超,黄炳成,闫歌,魏庆宽. 中国病原生物学杂志. 2016(12)
[5]柔嫩艾美耳球虫2个抗药株的抗药性评估[J]. 谢雨翔,韩红玉,赵其平,王自文,董辉,徐帅兵,朱顺海,崔晓霞,唐敏,杨志远,黄兵. 中国动物传染病学报. 2016(06)
[6]耿氏硬草对乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性水平及分子机制初探[J]. 袁国徽,王恒智,赵宁,路兴涛,刘伟堂,王金信. 农药学学报. 2016(03)
[7]乙酰辅酶A羧化酶B基因多态性与2型糖尿病的相关性研究[J]. 唐俊婷,李会芳,刘华,王玉明,宋滇平. 中国糖尿病杂志. 2016(01)
[8]鼠伤寒沙门菌ATCC13311诱导耐药株的转录组测序和分析[J]. 李琳,冯帅,汪莹,代兴杨,杨艳菲,曾明华. 中国兽医学报. 2015(07)
[9]乙酰辅酶A羧化酶基因多态性与冠心病关系[J]. 陈业达,张高华,梁岩,林美华,张乃尊,金律,饶绍奇. 中国公共卫生. 2015(09)
[10]抗精噁唑禾草灵的日本看麦娘ACCase基因突变[J]. 毕亚玲,吴翠霞,郭文磊,李琦,李蓉荣,王金信. 植物保护学报. 2015(03)
博士论文
[1]基于全基因组SNP对猪品种分子种质特性挖掘与保护的研究[D]. 李文婷.中国农业大学 2017
[2]骨膜蛋白在非小细胞肺癌中的作用及相关机制的研究[D]. 胡文霞.河北医科大学 2017
[3]空肠弯曲菌酰胺醇类诱导耐药株与敏感株的组学比较研究[D]. 李会.中国农业大学 2015
[4]中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性研究[D]. 朱国鼎.苏州大学 2014
[5]应用全基因组重测序技术初步探讨瘢痕增生的发病机制[D]. 刘畅.中国人民解放军医学院 2014
[6]牙鲆微卫星标记的筛选和美洲牡蛎抗病相关基因SNP的初步分析[D]. 于海洋.中国海洋大学 2010
[7]羊胃肠线虫对常用驱虫药抗药性的初步研究[D]. 蔡葵蒸.内蒙古农业大学 2007
[8]带科主要绦虫45W和14ku/18ku基因变异的研究[D]. 贾万忠.中国农业科学院 2003
硕士论文
[1]浮游态和生物被膜状态嗜水气单胞菌对四环素耐药相关蛋白的研究[D]. 李碗芯.福建农林大学 2016
[2]中华按蚊线粒体基因组进化及抗药性相关基因多态性研究[D]. 王琰.第二军医大学 2015
[3]柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的初步研究[D]. 翟颀.中国农业科学院 2015
[4]基于SNP的捻转血矛线虫（H.contortus）遗传多样性分析及P-糖蛋白基因核苷酸差异位点筛选[D]. 葛程.上海师范大学 2015
[5]P2X7受体和TCP-1蛋白在淋巴瘤中的表达及相关性研究[D]. 曾佳.大连医科大学 2013
[6]细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测[D]. 吴巨龙.兰州大学 2013
[7]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究[D]. 李洋.中国农业科学院 2010
本文编号：2915111
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纯化的柔嫩艾美耳球虫4个阶段虫体Fig.2.1Purified4developmentalstagesofEimeriatenellaA：孢子化卵囊（×200）；B：未孢子化卵囊（×200）；C：子孢子（×200）；D：裂殖子（×400）
经凝胶电泳分析其完整性（图2.2），可见提取的总 RNA 具有典型的 3 个条带，表明提取的 RNA 未被降解，完整性较好。分光光度计检测结果 OD260/OD280=1.93，表明 RNA 未被蛋白质和 DNA 污染，可进行下一步的反转录，用反转录 M-MLV 试剂盒，得到柔嫩美耳球虫孢子化卵囊的 cDNA 第一链，保存于-20℃。
中国农业科学院硕士学位论文 第二章 4 个耐药相关基因的克隆和生物信息学分析因的 cDNA 片段。2.3.3.4 EtMDH 基因的 ORF 克隆根据 EtMDH 基因 ORF 序列，设计特异性引物，以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊 cDNA 为模板，设定合适的退火温度进行 PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，可以发现在 954 bp处有特异性的单一条带（图 2.3D），与预期条带位置相符；将条带位置正确的 PCR 产物切下，用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行回收。纯化后的 PCR 产物与 pGEM-T-easy 载体 4℃条件下连接 8h 后，将连接产物转入大肠杆菌 TOP10 感受态细胞中，在 LB 固体平板中挑取阳性菌落进行培养，并用 PCR 对菌液进行鉴定和测序。测序结果与原序列比对正确，表明成功扩增获得 EtMDH 基因的 cDNA 片段。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗精噁唑禾草灵和甲基二磺隆看麦娘ACCase和ALS基因突变[J]. 赵宁,郭文磊,李伟,吕玲玲,刘伟堂,王金信. 植物保护学报. 2017(05)
[2]四个半LIM结构域蛋白1对人肝癌细胞紫杉醇耐药影响的研究[J]. 周蕾,姜妮,周心娜,王小利,任军. 中国临床药理学杂志. 2017(12)
[3]小檗碱对禽源大肠杆菌抑菌作用及耐药消除作用的转录组学分析[J]. 张石磊,翟向和,王春光,陈谏,贾泽,张铁. 中国畜牧兽医. 2017(05)
[4]恶性疟原虫与耐药性相关分子遗传标记的研究进展[J]. 徐超,黄炳成,闫歌,魏庆宽. 中国病原生物学杂志. 2016(12)
[5]柔嫩艾美耳球虫2个抗药株的抗药性评估[J]. 谢雨翔,韩红玉,赵其平,王自文,董辉,徐帅兵,朱顺海,崔晓霞,唐敏,杨志远,黄兵. 中国动物传染病学报. 2016(06)
[6]耿氏硬草对乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性水平及分子机制初探[J]. 袁国徽,王恒智,赵宁,路兴涛,刘伟堂,王金信. 农药学学报. 2016(03)
[7]乙酰辅酶A羧化酶B基因多态性与2型糖尿病的相关性研究[J]. 唐俊婷,李会芳,刘华,王玉明,宋滇平. 中国糖尿病杂志. 2016(01)
[8]鼠伤寒沙门菌ATCC13311诱导耐药株的转录组测序和分析[J]. 李琳,冯帅,汪莹,代兴杨,杨艳菲,曾明华. 中国兽医学报. 2015(07)
[9]乙酰辅酶A羧化酶基因多态性与冠心病关系[J]. 陈业达,张高华,梁岩,林美华,张乃尊,金律,饶绍奇. 中国公共卫生. 2015(09)
[10]抗精噁唑禾草灵的日本看麦娘ACCase基因突变[J]. 毕亚玲,吴翠霞,郭文磊,李琦,李蓉荣,王金信. 植物保护学报. 2015(03)
博士论文
[1]基于全基因组SNP对猪品种分子种质特性挖掘与保护的研究[D]. 李文婷.中国农业大学 2017
[2]骨膜蛋白在非小细胞肺癌中的作用及相关机制的研究[D]. 胡文霞.河北医科大学 2017
[3]空肠弯曲菌酰胺醇类诱导耐药株与敏感株的组学比较研究[D]. 李会.中国农业大学 2015
[4]中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性研究[D]. 朱国鼎.苏州大学 2014
[5]应用全基因组重测序技术初步探讨瘢痕增生的发病机制[D]. 刘畅.中国人民解放军医学院 2014
[6]牙鲆微卫星标记的筛选和美洲牡蛎抗病相关基因SNP的初步分析[D]. 于海洋.中国海洋大学 2010
[7]羊胃肠线虫对常用驱虫药抗药性的初步研究[D]. 蔡葵蒸.内蒙古农业大学 2007
[8]带科主要绦虫45W和14ku/18ku基因变异的研究[D]. 贾万忠.中国农业科学院 2003
硕士论文
[1]浮游态和生物被膜状态嗜水气单胞菌对四环素耐药相关蛋白的研究[D]. 李碗芯.福建农林大学 2016
[2]中华按蚊线粒体基因组进化及抗药性相关基因多态性研究[D]. 王琰.第二军医大学 2015
[3]柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的初步研究[D]. 翟颀.中国农业科学院 2015
[4]基于SNP的捻转血矛线虫（H.contortus）遗传多样性分析及P-糖蛋白基因核苷酸差异位点筛选[D]. 葛程.上海师范大学 2015
[5]P2X7受体和TCP-1蛋白在淋巴瘤中的表达及相关性研究[D]. 曾佳.大连医科大学 2013
[6]细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测[D]. 吴巨龙.兰州大学 2013
[7]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究[D]. 李洋.中国农业科学院 2010
本文编号：2915111
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