金纳米探针结合暗场显微镜定量检测肺炎衣原体的研究
发布时间：2020-12-17 01:26
肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae,C.pneumoniae,C.pn）是一种专性胞内寄生的衣原体属微生物,能够感染人和马、考拉等多种家养及野生动物,是一种重要的人畜共患病原体。C.pn急性感染会导致咽炎、鼻窦炎、支气管炎、肺炎等一系列呼吸系统疾病,慢性持续感染则与肺癌、哮喘、阿尔兹海默病和冠心病等重要心血管疾病的致病原因密切相关。由于缺乏特征性临床症状,因此需要在实验室进一步进行鉴定。目前临床检测手段主要包括分离培养法、酶联免疫吸附反应（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、微量免疫荧光试验（Micro-immunofluorescence,MIF）、PCR分子检测技术等。但分离培养法耗时长,对早期诊断意义不大。Cpn感染中特异性IgG、IgM上升缓慢,血清学检测会贻误检测时间。PCR方法操作复杂,对检测环境要求较高,易产生假阳性,导致难以商业化,一般用于实验研究。目前缺乏一种对环境要求低,高灵敏、易操作的C.pn检测技术。纳米材料应用于生物传感器的设计已经在生命科学等多个领域受到了广泛研究,利用纳米材料独特的光学性质、磁...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１细胞形态的变化
３．３?Ｃ．／ｗ的ＲＴ－ｑＰＣＲ检测法的建立??３．３．１?〇？？的ＲＴ－ｑＰＣＲ检测法特异性的判定??ＰＣＲ程序完成后，分析各检测样品的高分辨率熔解曲线（图１－３），其中Ｃ．ｐ？样品会??在相应６５°Ｃ处形成溶解峰，同时此ＲＴ－ｑＰＣＲ方法不会扩增ｃｏ／；＇的核酸样??品和妙／ｚ／ｍｗｒ／画的核酸样品。??０．３０?＂Ｉ???０?２５?／＼?￣?Ｃ，Ｐｎ??／?＼?—?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ｔｙｐｈｉｍｗｌｕｍ??〇?０?２０－?／?＼?一￣?Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ?ｃｏｌｉ??芸?ｉ?Ｖ?—￣?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??！?°－１５－?ｙ?＼??ｉ?０－１０?■一＼??ｓ?０．０５－?＼??丫．????？０．０５－??５４?５６?５８?６０?６２?６４?６６?６８?７０?７２?７４?７６?７８??Ｔｅｍｐｅｒａ?ｔｉｌ?ｒｅ＾Ｃ）??图１－３高分辨率熔解曲线。??Ｆｉｇ．?１－３?Ｈｉｇｈ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｍｅｌｔｉｎｇ?ｃｕｒｖｅ．??３．３．２细胞培养Ｃ，样品的检测??采用己建立的ＲＴ－ｑＰＣＲ系统，扩增经ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法定量后梯度稀释为１０５、Ｉ０４、１０３、??１０２、１０１、１０Ｑｃｏｐｉｅｓ／（ｘＬ的Ｃ．ｐ？核酸样品，结果显示，除ｌＯＧｃｏｐｉｅｓ／ｆｉＬＣ．／ｗ核酸样品结果??为阴性，其他各浓度的样品高分辨熔解曲线峰值和峰形保持一致，且扩增曲线峰形相似，??循环阈值（Ｃｔ值）均小于４０，判断均为阳性，证明该方法重复性较好，可用于Ｃ．／ｗ定量??检测。将如上核酸样品作为标准品与细胞培养的新鲜核酸样品同时进行ＰＣＲ反应
３．结果??３．１探针制备及配比优化??各种成分比例的探针电泳结果（图２－１）显示，ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎＡ和抗体可以得到大小??不同的蛋白条带，各探针中均包含两种蛋白条带，说明该探针制备方法是可行的，抗体己??成功修饰ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎＡ。质量比例为３：２、３：４和３：８的探针电泳条带中抗体条带逐渐变??浓，而质量比例３：１０和３：１２的探针电泳条带中抗体条带浓度与前一条带保持相同，说明??质量比例为３：８的探针是最适比例，前两种质量比例中抗体量不足，而后两种质量比例则??是抗体量过剩。抗体量过少会影响探针与Ｃ．ｐｎ的结合效率，而抗体量过多会造成金纳米材??料聚团，影响其分散性。后续探针均采用３：?８的成分质量配比，制备过程可见（图２－２），??探针清洗过程中并未损耗太多ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａ，重悬后的探针工作液与同浓度??ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎＡ液体的均勾度基本一致，分散性未受太大影卩向。??ａｂｃｄｅｆ?ｇ?ｈ??１２０??ｉ〇〇?ｊｈｈ??
【参考文献】：
期刊论文
[1]肺炎衣原体所致急性呼吸道感染的临床特征及分布情况[J]. 吐尔洪·阿不来提,努力曼·阿不力米提. 世界最新医学信息文摘. 2018(69)
[2]单个等离子体纳米颗粒在生化分析和生物成像中的应用[J]. 雷刚,何彦. 物理化学学报. 2018(01)
[3]肺炎衣原体实验室诊断技术研究进展[J]. 胡文娟,郭东星,辛德莉. 传染病信息. 2016(03)
[4]肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法[J]. 程永婷,贾晓晖,马良,贾天军. 临床检验杂志. 2016(05)
[5]利用环介导等温扩增技术检测儿童咽拭子标本中肺炎支原体[J]. 李丹,李静宜,董艳青,任翊,田秀君,辛德莉. 山东大学学报(医学版). 2014(10)
[6]实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展[J]. 尹兵. 科技信息. 2010(17)
本文编号：2921151
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１细胞形态的变化
３．３?Ｃ．／ｗ的ＲＴ－ｑＰＣＲ检测法的建立??３．３．１?〇？？的ＲＴ－ｑＰＣＲ检测法特异性的判定??ＰＣＲ程序完成后，分析各检测样品的高分辨率熔解曲线（图１－３），其中Ｃ．ｐ？样品会??在相应６５°Ｃ处形成溶解峰，同时此ＲＴ－ｑＰＣＲ方法不会扩增ｃｏ／；＇的核酸样??品和妙／ｚ／ｍｗｒ／画的核酸样品。??０．３０?＂Ｉ???０?２５?／＼?￣?Ｃ，Ｐｎ??／?＼?—?Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ?ｔｙｐｈｉｍｗｌｕｍ??〇?０?２０－?／?＼?一￣?Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ?ｃｏｌｉ??芸?ｉ?Ｖ?—￣?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??！?°－１５－?ｙ?＼??ｉ?０－１０?■一＼??ｓ?０．０５－?＼??丫．????？０．０５－??５４?５６?５８?６０?６２?６４?６６?６８?７０?７２?７４?７６?７８??Ｔｅｍｐｅｒａ?ｔｉｌ?ｒｅ＾Ｃ）??图１－３高分辨率熔解曲线。??Ｆｉｇ．?１－３?Ｈｉｇｈ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｍｅｌｔｉｎｇ?ｃｕｒｖｅ．??３．３．２细胞培养Ｃ，样品的检测??采用己建立的ＲＴ－ｑＰＣＲ系统，扩增经ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法定量后梯度稀释为１０５、Ｉ０４、１０３、??１０２、１０１、１０Ｑｃｏｐｉｅｓ／（ｘＬ的Ｃ．ｐ？核酸样品，结果显示，除ｌＯＧｃｏｐｉｅｓ／ｆｉＬＣ．／ｗ核酸样品结果??为阴性，其他各浓度的样品高分辨熔解曲线峰值和峰形保持一致，且扩增曲线峰形相似，??循环阈值（Ｃｔ值）均小于４０，判断均为阳性，证明该方法重复性较好，可用于Ｃ．／ｗ定量??检测。将如上核酸样品作为标准品与细胞培养的新鲜核酸样品同时进行ＰＣＲ反应
３．结果??３．１探针制备及配比优化??各种成分比例的探针电泳结果（图２－１）显示，ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎＡ和抗体可以得到大小??不同的蛋白条带，各探针中均包含两种蛋白条带，说明该探针制备方法是可行的，抗体己??成功修饰ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎＡ。质量比例为３：２、３：４和３：８的探针电泳条带中抗体条带逐渐变??浓，而质量比例３：１０和３：１２的探针电泳条带中抗体条带浓度与前一条带保持相同，说明??质量比例为３：８的探针是最适比例，前两种质量比例中抗体量不足，而后两种质量比例则??是抗体量过剩。抗体量过少会影响探针与Ｃ．ｐｎ的结合效率，而抗体量过多会造成金纳米材??料聚团，影响其分散性。后续探针均采用３：?８的成分质量配比，制备过程可见（图２－２），??探针清洗过程中并未损耗太多ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａ，重悬后的探针工作液与同浓度??ＧＮＰ＠ｐｒｏｔｅｉｎＡ液体的均勾度基本一致，分散性未受太大影卩向。??ａｂｃｄｅｆ?ｇ?ｈ??１２０??ｉ〇〇?ｊｈｈ??
【参考文献】：
期刊论文
[1]肺炎衣原体所致急性呼吸道感染的临床特征及分布情况[J]. 吐尔洪·阿不来提,努力曼·阿不力米提. 世界最新医学信息文摘. 2018(69)
[2]单个等离子体纳米颗粒在生化分析和生物成像中的应用[J]. 雷刚,何彦. 物理化学学报. 2018(01)
[3]肺炎衣原体实验室诊断技术研究进展[J]. 胡文娟,郭东星,辛德莉. 传染病信息. 2016(03)
[4]肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法[J]. 程永婷,贾晓晖,马良,贾天军. 临床检验杂志. 2016(05)
[5]利用环介导等温扩增技术检测儿童咽拭子标本中肺炎支原体[J]. 李丹,李静宜,董艳青,任翊,田秀君,辛德莉. 山东大学学报(医学版). 2014(10)
[6]实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展[J]. 尹兵. 科技信息. 2010(17)
本文编号：2921151
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